Определение на кариотипа

Появата на хромозомите се променя значително по време на клетъчния цикъл: по време на интерфазата хромозомите са локализирани в ядрото, като правило, деспирализирани и трудни за наблюдение, следователно клетките в един от етапите на тяхното делене, метафазата на митоза, се използват за определяне на кариотипа.

Процедура за определяне на кариотипа

За процедурата за определяне на кариотипа може да се използва всяка популация от делящи се клетки. За определяне на човешкия кариотип по правило се използват лимфоцити от периферна кръв, чийто преход от стадия на покой G0 към пролиферация се провокира от добавянето на митоген на фитохемаглутинин. За определяне на кариотипа могат да се използват и клетки от костен мозък или първична култура от кожни фибробласти. За да се увеличи броят на клетките в етапа на метафаза, малко преди фиксирането, към клетъчната култура се добавят колхицин или нокадазол, които блокират образуването на микротубули, като по този начин предотвратяват разпространението на хроматидите до полюсите на клетъчното делене и завършването на митозата.

След фиксиране препарати от метафазни хромозоми се оцветяват и фотографират; от микрографии образуват т.нар систематизиран кариотип- номериран набор от двойки хомоложни хромозоми, докато изображенията на хромозомите са ориентирани вертикално с късите им рамена нагоре, номерирането им се извършва в низходящ ред на размера, двойка полови хромозоми се поставя в края на набора (виж фиг. 1).

Исторически, първите неподробни кариотипове, които направиха възможно класифицирането според морфологията на хромозомите, бяха получени чрез оцветяване по Романовски-Гимза, но по-нататъшното детайлизиране на структурата на хромозомите в кариотипите стана възможно с появата на диференциални техники за оцветяване на хромозоми . Най-често използваната техника в медицинската генетика е G-диференциалното оцветяване на хромозомите.

Класически и спектрални кариотипи

Ориз. Фиг. 2. Пример за определяне на транслокация по комплекс от напречни белези (ивици, класически кариотип) и по спектър от области (цвят, спектрален кариотип).

За да се получи класически кариотип, се използва оцветяване на хромозоми с различни багрила или техни смеси: поради разликите в свързването на багрилото с различни части на хромозомите, оцветяването става неравномерно и се образува характерна лентова структура (комплекс от напречни белези , инж. обвързване), отразяващ линейната хетерогенност на хромозомата и специфичен за хомоложни двойки хромозоми и техните региони (с изключение на полиморфните области, локализирани са различни алелни варианти на гени). Първият метод за оцветяване на хромозоми за получаване на толкова детайлни изображения е разработен от шведския цитолог Касперсон (Q-оцветяване).Използват се и други оцветявания, тези техники се наричат ​​общо диференциално оцветяване на хромозоми:

  • Q-оцветяване- оцветяване по Kaspersson с акрихинова горчица с изследване под флуоресцентен микроскоп. Най-често се използва за изследване на Y хромозоми (бързо определяне на генетичен пол, откриване на транслокации между X и Y хромозоми или между Y хромозома и автозоми, скрининг за мозаицизъм, включващ Y хромозоми)
  • G-оцветяване- модифицирано оцветяване по Romanovsky - Giemsa. Чувствителността е по-висока от тази на Q-оцветяването, поради което се използва като стандартен метод за цитогенетичен анализ. Използва се за откриване на малки аберации и маркерни хромозоми (сегментирани по различен начин от нормалните хомоложни хромозоми)
  • R-оцветяване- използват се акридиново портокал и подобни багрила, докато се оцветяват части от хромозомите, които са нечувствителни към G-оцветяване. Използва се за разкриване на подробности за хомоложни G- или Q-отрицателни области на сестрински хроматиди или хомоложни хромозоми.
  • С-оцветяване- използва се за анализ на центромерните области на хромозомите, съдържащи конститутивен хетерохроматин и променливата дистална част на Y хромозомата.
  • Т-оцветяване- използва се за анализ на теломерни области на хромозомите.

Напоследък техниката на т.нар. спектрално кариотипиране (флуоресцентна хибридизация на място, Английски Флуоресценцияна място хибридизация, FISH), състояща се в оцветяване на хромозоми с набор от флуоресцентни багрила, които се свързват със специфични области на хромозомите. В резултат на такова оцветяване хомоложните двойки хромозоми придобиват идентични спектрални характеристики, което не само значително улеснява идентифицирането на такива двойки, но също така улеснява откриването на междухромозомни транслокации, тоест движения на участъци между хромозоми - транслокираните участъци имат спектър което се различава от спектъра на останалата част от хромозомата.

Анализ на кариотипа

Сравнението на комплекси от напречни белези в класическото кариотипиране или региони със специфични спектрални характеристики дава възможност да се идентифицират както хомоложни хромозоми, така и техните отделни области, което дава възможност да се определят подробно хромозомни аберации - интра- и междухромозомни пренареждания, придружени от нарушение на реда на хромозомните фрагменти (делеции, дупликации, инверсии, транслокации). Такъв анализ е от голямо значение в медицинската практика, което прави възможно диагностицирането на редица хромозомни заболявания, причинени както от груби нарушения на кариотипите (нарушение на броя на хромозомите), така и от нарушение на хромозомната структура или множеството клетъчни кариотипове в тялото (мозаицизъм).

Номенклатура

Фиг.3. Кариотип 46,XY,t(1;3)(p21;q21), del(9)(q22): показани са транслокация (прехвърляне на фрагмент) между 1-ва и 3-та хромозома, делеция (загуба на участък) на 9-та хромозома. Маркирането на хромозомните участъци се дава както от комплекси от напречни белези (класическо кариотипиране, ивици), така и от флуоресцентния спектър (цвят, спектрално кариотипиране).

За систематизиране на цитогенетичните описания е разработена Международната система за цитогенетична номенклатура (ISCN), базирана на диференциално оцветяване на хромозомите и позволяваща подробно описание на отделните хромозоми и техните региони. Записът има следния формат:

[номер на хромозомата] [ръка] [номер на обекта].[номер на лентата]

дългото рамо на хромозомата се обозначава с буквата q, кратко - писмо стр, хромозомните аберации се обозначават с допълнителни символи.

По този начин 2-рата лента на 15-ия участък на късото рамо на 5-та хромозома се записва като 5p15.2.

За кариотипа се използва запис в системата ISCN 1995, който има следния формат:

[брой хромозоми], [полови хромозоми], [характеристики].

Анормални кариотипи и хромозомни заболявания

Нормалните човешки кариотипове са 46,XX (жени) и 46,XY (мъжки). Нарушенията на нормалния кариотип при хората възникват в ранните етапи на развитието на организма: ако такова нарушение се случи по време на гаметогенезата, при която се произвеждат зародишните клетки на родителите, кариотипът на зиготата, образуван по време на тяхното сливане, също се нарушава . При по-нататъшно разделяне на такава зигота всички клетки на ембриона и на организма, който се е развил от него, имат същия анормален кариотип.

Въпреки това, кариотипните нарушения могат да се появят и в ранните етапи на фрагментация на зигота, организмът, който се е развил от такава зигота, съдържа няколко клетъчни линии (клетъчни клонове) с различни кариотипове, такова множество кариотипове на целия организъм или неговите отделни органи е наречен мозаицизъм.

По правило нарушенията на кариотипа при хората са придружени от множество малформации; повечето от тези аномалии са несъвместими с живота и водят до спонтанни аборти в ранните етапи на бременността. Въпреки това, доста голям брой фетуси (~2,5%) с анормални кариотипи издържат до края на бременността.

Някои човешки заболявания, причинени от аномалии на кариотипа,
Кариотипове Болест Коментар
47,XXY; 48,XXXY; Синдром на Клайнфелтер Х хромозомна полизомия при мъже
45X0; 45X0/46XX; 45,X/46,XY; 46.X iso (Xq) Синдром на Шерешевски-Търнър Монозомия на Х хромозомата, включително мозаицизъм
47,XXX; 48, XXXX; 49,XXXXXX Полизомия на Х хромозомата Най-често срещаната тризомия X
47,XX, 21+; 47,XY, 21+ Синдром на Даун Тризомия на 21-ва хромозома
47,XX, 18+; 47,XY, 18+ Синдром на Едуардс Тризомия на 18-та хромозома
47,XX, 13+; 47,XY, 13+ Синдром на Патау Тризомия на 13-та хромозома
46,XX, 5p- синдром на плачещата котка делеция на късото рамо на 5-та хромозома
46 XX или XY, 15r-. Синдром на Прадер-Уили Аномалия 15 хромозоми

Кариотип на някои биологични видове

Всеки вид организми има характерен и постоянен набор от хромозоми. Броят на диплоидните хромозоми варира от организъм до организъм:

Кариотип на хоминида

Вижте също

  • Теория за наследствеността

Бележки

Връзки

  • Барбара Дж. Траск, Човешка цитогенетика: 46 хромозоми, 46 години и броене. Прегледи на природата, октомври 2002 г., кн. 3, стр. 769-778 (пълният текст на рецензията на сайта на авторската лаборатория в Центъра за изследване на рака на Фред Хътчинсън)
хромозоми
Основен КариотипПлоидна мейоза Митоза
Класификация Автозомна гонозома Микрохромозома Политенна хромозома Лампа четка хромозоми
структура
Хроматиди Cohesin Sister хроматиден обмен

Кариотип , набор от характеристики на хромозомния набор, характерни за всеки биологичен вид. Тези признаци включват:

  • номер,
  • размер и форма на хромозомите
  • позиция върху хромозомите на първичната свивка (центромер),
  • наличието на вторични стеснения,
  • редуване на хетерохроматични и еухроматични области и др.

Кариотипът служи като "паспорт" на вида, който надеждно го отличава от кариотиповете на други видове. Постоянството на всички знациВидовият кариотип се осигурява от точните процеси на разпределение на хромозомите между дъщерните клетки при митоза и мейоза (тези процеси могат да бъдат нарушени от хромозомни мутации).

Кариотипът е пълен набор от хромозоми в човешки клетки. Нормата за съдържанието на хромозоми в соматичните (неембрионални) човешки клетки е 46 хромозоми, организирани в 23 двойки. Всяка двойка се състои от една хромозома от майката и една от бащата.

Външен вид на хромозомитесе променя значително по време на клетъчния цикъл: по време на интерфазата хромозомите са локализирани в ядрото, като правило, деспирализирани и трудни за наблюдение, следователно клетките в един от етапите на тяхното делене се използват за определяне на кариотипа - метафаза на митоза.

Хромозомите в светлинния микроскоп на етап метафаза са ДНК молекулиопаковани със специфични протеини плътни свръхнавити пръчковидни структури. По този начин голям брой хромозоми се опаковат в малък обем и се поставят в относително малък обем на клетъчното ядро. Подреждането на хромозомите, наблюдавано под микроскоп, е фотографирано и сглобено от няколко снимки. систематизиран кариотип- номериран набор от хромозомни двойки хомоложни хромозоми. В този случай изображенията на хромозомите са ориентирани вертикално, с къси рамена нагоре, а номерирането им се извършва в низходящ ред на размера. Двойка полови хромозоми (X и Y за мъж, X и X за жена) се поставят в самия край на изображението на набора от хромозоми.

При изследване на кариотипа, което обикновено се извършва на етап метафаза на клетъчния цикъл, се използват следното:

  • микрофотография,
  • специални методи за оцветяване на хромозоми и други методи.

За да се получи класически кариотип, се използва оцветяване на хромозоми с различни багрила или техни смеси: поради разликите в свързването на багрилото с различни части на хромозомите, оцветяването става неравномерно и се образува характерна лентова структура(комплекс от напречни белези), отразяващ линейната хетерогенност на хромозомата и специфичен за хомоложни двойки хромозоми и техните региони (с изключение на полиморфни области, локализирани са различни алелни варианти на гени). Първият метод за оцветяване на хромозоми за получаване на толкова детайлни изображения е разработен от шведския цитолог Касперсон (Q-оцветяване). Използват се и други багрила, такива техники са получили общото име диференциално оцветяване на хромозоми.

Видове диференциално оцветяване на хромозоми

  • G-оцветяване - модифицирано оцветяване по Романовски - Гимза. Чувствителността е по-висока от тази на Q-оцветяването, поради което се използва като стандартен метод за цитогенетичен анализ. Използва се за откриване на малки аберации и маркерни хромозоми (сегментирани по различен начин от нормалните хомоложни хромозоми).
  • Q-оцветяване - оцветяване по Касперсон с акрилен горчица с изследване под флуоресцентен микроскоп. Най-често се използва за изследване на Y хромозоми (бързо определяне на генетичен пол, идентифициране на транслокации между X и Y хромозоми или между Y хромозома и автозоми, скрининг за мозаицизъм, включващ Y хромозоми).
  • R-оцветяване - използват се акридиново оранжево и подобни багрила, докато се оцветяват части от хромозомите, които са нечувствителни към G-оцветяване. Използва се за разкриване на подробности за хомоложни G- или Q-отрицателни области на сестрински хроматиди или хомоложни хромозоми.
  • C-оцветяване - използва се за анализ на центромерните области на хромозомите, съдържащи конститутивен хетерохроматин и променливата дистална част на Y хромозомата.
  • Т-оцветяване - използва се за анализ на теломерните области на хромозомите.

Напоследък т.нар спектрално кариотипиране (флуоресцентна хибридизация FISH), който се състои в оцветяване на хромозоми с набор от флуоресцентни багрила, които се свързват със специфични области на хромозомите. В резултат на такова оцветяване хомоложните двойки хромозоми придобиват идентични спектрални характеристики, което не само значително улеснява идентифицирането на такива двойки, но също така улеснява откриването на междухромозомни транслокации, тоест движения на участъци между хромозоми - транслоцираните участъци имат спектър което се различава от спектъра на останалата част от хромозомата.

Резултатите са представени като кариограми(систематизирано подреждане на хромозоми, изрязани от микроснимка) или идеограми- схематично представяне на хромозоми, подредени в редица с намаляване на дължината им.

Сравнителният анализ на кариотипите се използва в кариосистематиката за определяне на еволюционните пътища на кариотипите, за определяне на произхода на домашни животни и културни растения, за идентифициране на хромозомни аномалии, водещи до наследствени заболявания и др.

Кариотипът може да се определи като набор от хромозоми на соматични клетки, включително структурни характеристики на хромозомите. В многоклетъчните организми всички соматични клетки съдържат един и същ набор от хромозоми, тоест имат един и същ кариотип. При диплоидните организми кариотипът е диплоидният набор от хромозоми в клетката.

Концепцията за кариотип се използва не толкова по отношение на индивид, колкото по отношение на вид. В този случай те казват това кариотипът е видоспецифичен, тоест всеки вид организми има свой специален кариотип. И въпреки че броят на хромозомите при различните видове може да съвпада, но в тяхната структура те винаги имат една или друга разлика.

Въпреки че кариотипът е предимно видова характеристика, той може да варира донякъде при индивидите от един и същи вид. Най-очевидната разлика е неравнопоставените полови хромозоми в женските и мъжките организми. Освен това могат да възникнат различни мутации, водещи до аномалии в кариотипа.

Броят на хромозомите и нивото на организация на даден вид не корелират един с друг.С други думи, голям брой хромозоми не показва високо ниво на организация. Така че ракът отшелник има 254 от тях, а Drosophila има само 8 (и двата вида принадлежат към членестоноги); кучето има 78, а човекът 46.

Кариотипите на диплоидни (соматични) клетки се състоят от двойки хомоложни хромозоми. Хомоложните хромозоми са идентични по форма и генен състав (но не и по алели). Във всяка двойка една хромозома отива в тялото от майката, другата е бащина.

Изследване на кариотипа

Клетъчните кариотипове се изследват в метафазния стадий на митозата. През този период на клетъчно делене хромозомите са максимално спираловидни и са ясно видими под микроскоп. В допълнение, метафазните хромозоми се състоят от две (сестрински) хроматиди, свързани в центромера.

Секцията на хроматидата между центромера и теломера (разположена в края от всяка страна) се нарича рамо. Всяка хроматида има две рамена. Късото рамо се обозначава с p, а дългото с q. Има метацентрични хромозоми (рамена са приблизително равни), субметацентрични (едно рамо е очевидно по-дълго от другото), акроцентрични (всъщност се наблюдава само рамо q).

При анализа на кариотипа хромозомите се идентифицират не само по техния размер, но и по съотношението на раменете. При всички организми от един и същи вид нормалните кариотипове за тези черти (размер на хромозомите, съотношение на раменете) са еднакви.

Цитогенетичният анализ включва идентифициране на всички хромозоми от кариотипа. В този случай цитологичният препарат се подлага на диференциално оцветяване с помощта на специални багрила, които специфично се свързват с различни области на ДНК. В резултат на това хромозомите придобиват специфичен модел на набраздяване, което позволява да бъдат идентифицирани.

Метод на диференциално оцветяванее открит през 60-те години на XX век и дава възможност за пълен анализ на кариотипите на организмите.

Кариотипът обикновено се представя като идиограма.(вид схема), където всяка двойка хромозоми има свой собствен номер, а хромозомите от същия морфологичен тип се комбинират в групи. В група хромозомите са подредени по размер от най-големия до най-малкия. По този начин всяка двойка хомоложни кариотипни хромозоми на идиограмата има свой собствен номер. Често се изобразява само една хромозома от двойка хомолози.

За хората, много лабораторни и селскостопански животни, за всеки метод на оцветяване са разработени схеми за набраздяване на хромозомите.

Хромозомните маркери са ленти, които се появяват при оцветяване. Лентите са групирани в региони. И лентите, и регионите са номерирани от центромер до теломер. Някои ленти могат да показват локализирани гени.

Запис на кариотипа

Кариотипният запис носи определена характеристика за него. Първо се посочва общият брой хромозоми, след това наборът от полови хромозоми. При наличие на мутации първо се посочват геномни мутации, след това хромозомни. Най-често срещаните са: + (допълнителна хромозома), del (делеция), dup (дупликация), inv (инверсия), t (транслокация), rob (робертсонова транслокация).

Примери за записване на кариотипове:

48, XY - нормален кариотип на мъжко шимпанзе;

44, XX, del (5)(p2) - кариотип на женски заек, при който е настъпило делене на втория сегмент на късото (p) рамо на петата хромозома.

Човешки кариотип

Човешкият кариотип се състои от 46 хромозоми, които са точно определени през 1956 г.

Преди откриването на диференциалното оцветяване, хромозомите бяха класифицирани според тяхната обща дължина и техния центромерен индекс, който е съотношението на дължината на късото рамо на хромозомата към нейната обща дължина. Метацентрични, субметацентрични и акроцентрични хромозоми са открити в човешкия кариотип. Идентифицирани са и полови хромозоми.

По-късно използването на диференциални методи за оцветяване направи възможно идентифицирането на всички хромозоми на човешкия кариотип. През 70-те години на миналия век са разработени правила (стандарт) за тяхното описание и обозначение. Така автозомите бяха разделени на групи, обозначени с букви, всяка от които включваше хромозоми с определен брой: A (1-3), B (4, 5), C (6-12), D (13-15), E ( 16-18), Ж (19, 20), Ж (21, 22). Половите хромозоми са 23-та двойка.

Нормалният човешки кариотип се записва така:

46, XX - за жена,

46, XY - за мъж.

Примери за човешки кариотипове с аномалии:

47, XX, 21+ - жена с допълнителна 21-ва хромозома;

45, XY, rob (13, 21) - мъж, който е имал Робъртсонова транслокация на 13-та и 21-ва хромозоми.

Въведение ................................................. ................................................ .. един

Глава 1. Митотични хромозоми................................................ .. .............. 2

Глава 2. Мейотични хромозоми ........................................ ................. пет

Глава 3. Цитогенетичен метод.................................................. .. ............... 13

Глава 4. Полов хроматин ........................................ ........................ двадесет

Глава 5. Мозаицизъм ................................................ ........................................................ 23


Един от ключовите въпроси на човешката генетика е въпросът за структурата и функционирането на материалните основи на наследствеността. Информацията за всяко от трите нива на организация на наследствените структури (генетична, хромозомна, геномна) се натрупва през последните години с изненадваща скорост и може да се надяваме, че не е далеч времето, когато ще се създаде доста пълна картина на човешката наследственост. съставен. Дори сега, по този въпрос, човек може да бъде приписан към броя на най-добре проучените обекти заедно с дрозофила, мишки и царевица.

За правилното разбиране на значението на наследствеността в човешката патология е необходимо да имате подробна информация за три частично свързани помежду си раздела:

1) според морфологичната и химичната структура на хромозомите и кариотипа като цяло; 2) според отделни черти на човек, контролиран от единични гени („инвентар“ на единици на наследствена вариабилност); 3) според "архитектониката" на гените в хромозомите (свързване на гени и карти на хромозоми). За всеки един от тези раздели са натрупани много данни и тяхното интензивно развитие продължава както в теоретичен, така и в приложен (клиничен) аспект.

Принципите и основните раздели на общата цитогенетика се формират през 20-те и 30-те години на миналия век главно поради изследвания, проведени върху дрозофила и някои растения. Цитогепетиката на човека и бозайниците, която заема водещо място в съвременната цитогенетика, се развива по-късно, главно поради методологични трудности.

Историята на развитието на човешката цитогенетика може да бъде разделена на три периода. Първият обхваща периода от миналия век до средата на 50-те години на миналия век и сега представлява чисто исторически интерес. Това са търсенето на методически подходи за получаване на препарати от човешки хромозоми от тогавашните цитолози, забележителни със своята постоянство и старание (AG Andres, 1934). Въпреки че нашите цитогенетици A. G. Andres и M. S. Navashin правилно описват първите 10 двойки големи хромозоми, дори общият брой хромозоми в човешките клетки не е надеждно установен. Тяхната морфология също остава неизвестна.

Вторият период, иницииран от работата на Тио и Леван през 1956 г., се характеризира с появата и бързото развитие на съвременната човешка цитогенетика. Доста бързо бяха разработени всички основни методологични методи за хромозомен анализ, беше получена фундаментална информация за човешкия кариотип, за основните характеристики на структурата и функционирането на неговите нормални хромозоми. Именно през този период се ражда медицинската цитогенетика, която отваря нова област на човешката патология, поради промяна в броя или структурата на хромозомите.

Третият период в развитието на човешката цитогенетика започва през 70-те години на миналия век. С право може да се счита за начало на съвременния етап в развитието на науката за цитологичните основи на човешката наследственост. Редица методологични иновации осигуриха прехода на цитогенетиката към качествено ново ниво. Реализирана е възможността за изследване на индивидуалността на човешките хромозоми и дори на техните сегменти. Това незабавно издигна медицинската цитогенетика на ново ниво. Стана възможно цялостно изследване на морфологията, функцията, химичните характеристики на структурата и надмолекулната организация на човешките хромозоми. Развитието през същите години на методи за генетично картографиране на човешки хромозоми осигури решението на най-трудния проблем - създаването на генетични карти на хромозомите.

По този начин съвременната човешка цитогенетика е богата на фактически материал, разклонена независима област на човешката генетика. Понастоящем проблемът за идентифициране на всички елементи на човешкия кариотип в анализа на етапа на митоза е решен въз основа на използването на диференциални хромозомни оцветявания.

Хромозомите като отделни структури стават достъпни за изследване след значително скъсяване и удебеляване, което изпитват по време на подготовката на клетката за делене. За соматичните клетки това деление е митоза, за генеративните клетки първо митоза, а след това мейоза.

Глава 1. Митотични хромозоми.

Основна информация за човешкия хромозомен набор като цяло и за отделните хромозоми е получена в резултат на изследване на хромозомите в метафазата на митозата. На този етап на митозата ясно се вижда, че диплоидният набор от човешки хромозоми се състои от 46 елемента: 22 двойки автозоми и една двойка полови хромозоми (XX при жените и XY при мъжете). При стандартно оцветени препарати формата на метафазните хромозоми се определя от местоположението на първичната констрикция, която се образува поради декондензация на центромерната област, функционираща в метафаза. Допълнителни стеснения, наречени вторични стеснения, могат да съществуват на отделни хромозоми. В случай на локализация на такова свиване в края на хромозомата, дисталния сегмент на хромозомата, отделен от него, се нарича сателит.

По форма и общ размер всички човешки автозоми лесно се разделят на 7 групи, обозначени с латински букви от A до G (фиг. 8). Освен това всички автозоми са номерирани в ред на намаляваща обща дължина (от 1 до 22).

Дължината на една и съща хромозома при митоза варира значително, тъй като процесът на естествена кондензация на хромозомата продължава на етапа на метафаза, който се усилва значително от колхицин. Следователно индикаторът за относителната, а не за абсолютната дължина на хромозомата служи за идентифициране. Въпреки това, неговата надеждност е ограничена от факта, че хромозомите имат различни дължини и в дадена хромозома раменете с различни размери се свиват различно: по-късите са по-бързи от по-късите. Това не засяга горните характеристики на групата, но предотвратява идентифицирането на близки по размер и форма хромозоми в рамките на групите. Трудностите при индивидуалната идентификация на хромозомите също се влошават от факта, че диференциална кондензация може да се осъществи и между хомоложни хромозоми, причинявайки хомологичен хетероморфизъм. Понастоящем необходимостта от използване на метода на морфометрията и определените с него линейни параметри на хромозомата всъщност отпадна поради въвеждането в практиката на хромозомния анализ на диференциалното оцветяване на хромозомите.

Анализът на спонтанни вторични стеснения, включително сателитни, не улеснява значително разпознаването на отделни хромозоми. С тяхна помощ най-редовно може да се идентифицира автозома 9, която често има значително свиване в перицентромерната област на дългото рамо. Всичките десет човешки акроцентрични хромозоми имат сателитна констрикция; aD- или G-хромозомите не се различават по този признак в рамките на групите.

Морфологичната хомогенност на хромозомата по дължината, тъй като тя излиза от микроскопското изследване на метафазните хромозоми върху рутинно приготвени и оцветени препарати, всъщност се оказва подвеждаща. Методичният напредък в цитогенетиката на хората и висшите еукариоти като цяло, който се осъществи през последните 15-20 години, доведе до откриването на дълбока линейна диференциация на хромозомата по отношение както на структурата, така и на функцията. Тази диференциация, която е индивидуална за всяка хромозома, е относително лесна за откриване в метафазата на митозата. Поради това в съвременната човешка цитогенетика е възможно да се идентифицират всички хромозоми не по отделни и случайни признаци, а по съществените аспекти на тяхната структурна и функционална организация. В практиката на цитогенетичния анализ за тази цел се изследват диференциалната кондензация на хромозоми, хронологията на репликацията на ДНК в хромозомите или диференциалното оцветяване на хромозомите (AF Zakharov, 1977).

Диференциалната кондензация на хромозомните сегменти е една от основните му характеристики, най-пълно изразена в интерфазното ядро. При естествени условия на хода на митозата, хромозомните участъци, които се различават рязко по степента на кондензация през интерфазния период, изглеждат почти еднакви в метафазата. Само със специални методи на светлинна или електронна микроскопия е възможно да се открие нехомогенна линейна структура на външно хомогенна метафаза

хромозоми (Bahr and Larsen, 1974). Подравняването на циклите на кондензация в различни части на хромозомите може да бъде изкуствено инхибирано. За тази цел особено успешно се използва 5-бромодеоксиуридин (A. F. Zakharov, 1973, 1977;

Dutrillaux и Lejeune 1975). В присъствието на това вещество хромозомите влизат в метафазата неравномерно уплътнени по дължината си. В резултат на задълбочено изследване на тяхната морфология беше показано, че всяка човешка хромозома има строго постоянно и специфично редуване на нормално и слабо кондензирани области и може да бъде идентифицирана по този признак.

Интрахромозомната асинхронност на репликацията на ДНК е втората най-важна характеристика на линейната хетерогенност на хромозомата, която може да бъде открита в метафазата на митозата. От десетилетие и половина тази характеристика на хромозомната организация е достъпна за изследване по метода на хромозомната автография (под редакцията на A. A. Prokofieva-Belgovskaya, 1969; A. F. Zakharov, 1977; Giannelli, 1970, 1974). Въз основа на този метод бяха разкрити основните закономерности на възпроизвеждането на човешки хромозоми, сред които асинхронността на възпроизвеждането на различни части на хромозомата, постоянството и специфичността на реда на възпроизвеждане за дадена хромозома са най-важните. . Въпреки това, идентифицирането на отделни хромозоми е по-малко напреднало чрез авторадиография от очакваното. На автографите е възможно допълнително да се разграничат автозоми 4 и 5, 13, 14 и 15, 17 и 18. В женските клетки една от двете Х хромозоми се различава в късния старт и късния край на синтеза на ДНК. Въпреки ограничените данни, получени чрез авторадиография, тази техника се оказа изключително полезна за подобряване на идентифицирането на аномалии на тези хромозоми и помогна при идентифицирането на няколко нови независими синдрома в хромозомната патология.

Значителен напредък в изследването на последователността на синтеза на ДНК по дължината на всяка човешка хромозома е нормален, връзката й с други характеристики на хромозомната организация, състоянието й в случаи на числени или структурни промени в хромозомния набор, в момента се осъществява поради използването на тимидинов аналог като предшественик на синтеза на ДНК - 5-бромодеоксиуридин. Отслабената способност за оцветяване на хромозомни региони, които включват този предшественик, въоръжи цитогенетиците с точен метод за изследване на хронологията на хромозомното възпроизвеждане, чиито възможности са ограничени само от разделителната способност на светлинната микроскопия. Репликационната структура на всички човешки хромозоми е разкрита с най-голяма яснота и може да бъде описана с ясни морфологични термини.

Всяка хромозома се състои от региони, които се репликират в различно време. Има ясно редуване на области с ранна и късна репликация. На метафазната хромозома

такива зони са ясно видими със светлинен микроскоп. Специфичността на репликационната структура на всяка хромозома се състои в индивидуалния размер, брой и взаимно подреждане на различните хромозомни области (фиг. 9).

За разлика от горните два феномена на неравномерно оцветяване на хромозомите по дължината, причинено от включването на 5-бромодеоксиуридин в ДНК, диференциалното оцветяване на хромозомите означава способността за селективно оцветяване по дължината на хромозома, която не е била модифицирана in vivo от всякакви влияния. Диференциалното оцветяване на хромозомите в този случай се осигурява от относително прости температурно-солеви ефекти върху фиксирана хромозома.

Важно е да се отбележи, че при цялото разнообразие от такива обработки на хромозомни препарати след фиксиране и приложените флуорохромни или нефлуоресцентни багрила, откритата линейна хетерогенност на хромозомата е винаги една и съща. Моделът му се променя само в зависимост от степента на уплътняване на хромозомата: при по-дълги, по-слаби скъсени хромозоми става забележима по-нататъшна хетерогенност на тези сегменти, които изглеждаха хомогенно оцветени в силно кондензирани хромозоми. Диференциалното оцветяване може да се наблюдава или по цялата дължина на хромозомата (Q-, G- и R-сегменти), или в нейната центромерна област (С-сегменти).

Най-ясна представа за модела на диференциално оцветяване на хромозомите по цялата дължина може да се получи чрез оцветяване на препарати по G-метода с помощта на оцветяване по Giemsa (фиг. 10). На такива препарати хромозомите изглеждат като напречно набраздени, различно оцветени сегменти („ленти“). Моделът на всяка двойка хромозоми е специфичен за нея. Сегментите не са с еднакъв размер. В малките хромозоми от групи F и G моделът се формира от единични сегменти, в големите хромозоми има много от тях. Общият брой оцветени и неоцветени сегменти в нормален хромозомен набор със средна степен на кондензация, в съответствие с Парижката номенклатура, е 322. При прометафазните хромозоми техният брой нараства до 1000 или повече.

На Парижката конференция по номенклатура в човешката цитогенетика беше разработена система за обозначаване на сегменти от нормални хромозоми и хромозоми, подложени на различни структурни пренареждания, която сега навлезе в практиката на цитогенетичния анализ (ParisConference, 1971). На фиг. 11 показва пример за тази система за автозома 1.

Независимо от това как се решава въпросът за естеството на диференциалното оцветяване на хромозомите, цитологичните карти, базирани на този феномен, са от изключително значение за развитието на човешката цитогенетика. С тяхна помощ е възможно да се приписват генетични маркери не само на една или друга хромозомна ръка, а на определен регион на хромозомата. В медицинската цитогенетика стана възможно да се идентифицира произходът на анормалните хромозоми до точното описание на регионите.

Вторият тип диференциално оцветяване на хромозоми разкрива специфичността на перицентромерните области в човешките хромозоми. При различните хромозоми размерите на С-сегментите са различни, особено големи са в автозоми 1, 9 и 16. Въпреки това не е възможно да се идентифицират хромозоми, сходни по размер и форма по този цвят. В Y хромозомата С-хроматинът е локализиран в дисталната част на дългото рамо. В една и съща хромозома при различни индивиди съдържанието й може да варира.

Глава 2. Мейотични хромозоми.

Мейозата комбинира серия от различни процеси, чрез които първичните зародишни клетки се диференцират в зрели зародишни клетки. В началото на тази серия сперматогонията (оогония) се превръща в първични сперматоцити (ооцити). Централното събитие е първото мейотично делене на сперматоцита (ооцита), по време на което хромозомите претърпяват особено сложни специфични трансформации по време на профазния период. Първата мейотична профаза е разделена, както е известно, на пет етапа: лептотен, зиготен, пахитен, диплотен и диакинеза. За разлика от митозата, чиято профаза практически не се използва в цитогенетичния анализ, профазните хромозоми от първото мейотично деление са от голям интерес за човешката цитогенетика. Метафазните хромозоми от първото мейотично деление, които са биваленти на хомоложни хромозоми, са по-малко диференцирани структури в сравнение с метафазните митотични хромозоми. Хромозомите от второто мейотично деление почти никога не се използват в човешката цитогенетика.

Ходът на мейозата при мъжките и женските организми се различава значително в няколко аспекта: периодът на онтогенеза, продължителността на отделните фази и морфологията на митотичните трансформации.

При мъжете мейотичните деления започват в пубертета и продължават непрекъснато през цялото последващо полово зряло състояние. Този процес, за разлика от женската мейоза, не е цикличен. Голям брой гамети съзряват едновременно в тестисите, така че половите жлези на полово зрял мъж могат да служат като източник на мейотично делящи се клетки по всяко време. Върху хромозомните препарати е възможно едновременно да се видят различни мейотични фигури, от сперматогониални метафази до метафази на второто мейотично деление. Продължителността на трансформацията от сперматогония в сперматозоиди отнема около 8-9 седмици. Продължителността на отделните етапи е много различна, така че клетките на различни етапи се появяват с неравна честота. Етапите на пахитена и диакинеза, които са най-важни за цитогенетичния анализ, обикновено са представени от достатъчен брой клетки.

В женското тяло мейозата протича на два етапа, разделени от голям период от време. Първият етап, включващ образуването на оогония и преминаването на първото мейотично деление, се извършва в ембрионалните яйчници. До момента на раждането на момичето в яйчниците всички оогонии се диференцират в ооцити, като последните са преминали етапите на лептотен - пахитена и са спрели на етапа на диплотен. Престоят в този стадий, наречен диктиотен, продължава през целия постнатален период от живота на жената. Последващото развитие на клетката от стадия на диктиотен в зряла яйцеклетка протича циклично, една клетка на месец, и завършва с овулация. Горното обяснява защо ранните етапи на първото мейотично деление при жената могат да бъдат анализирани само в ранния ембрионален период, а следващите етапи не са достъпни за изследване при нормални условия.

Основна информация за организацията на човешките мейотични хромозоми е получена от изследването на клетките на тестисите. Могат да се разграничат следните аспекти на тези изследвания.

Анализ на линейната структура на отделните хромозоми.Характерна особеност на структурата на мейотичните хромозоми, изразена главно в първите етапи на профазата на мейозата, е тяхната хромомерна структура (фиг. 12). От данните за цитологията на мейотичните хромозоми на някои растителни видове е добре известна индивидуалността на хромомерната структура на всяка хромозома (Цитология и генетика на мейозата от В. В. Хвостова и Ю. В. Богданов, 1975). За съжаление, отделни биваленти в човешкия хромозомен набор, както мъжки, така и женски, могат да бъдат разграничени само в късната пахитена, когато те са значително намалени и хромомерността на тяхната структура е значително загубена. Въпреки това, в резултат на няколко опита за пахитичен анализ на хромозомите, беше получена първата информация за морфологията на бивалентите на акроцентричните и някои други хромозоми (под редакцията на A. A. Prokofieva-Belgovskaya, 1969; Hungeriord, 1973).

При идентифицирането на биваленти пахитени, C- и Q-методи за диференциално оцветяване бяха приложени с известен успех (Goetz, 1975). Намерено е пълно съгласие между моделите на G-оцветяване и хромомерната структура на пахитените хромозоми, както и между моделите на мейотични и митотични хромозоми, оцветени по G-метода (Lucianie. a., 1975).

Хромозомно конюгиране и образуване на хиазми.Изследването на диакинезата - метафаза I на мейозата в мъжките клетки показа, че хомоложната конюгация е задължителна за всички човешки хромозоми, включително късите. В един или друг бивалент има от 1 до 6 хиазма; според различни автори общият им брой на хромозомен набор варира от 35 до 66 (Ford, 1973). Разпределението на хиазмата в отделни биваленти стана възможно да се анализира, след като всеки бивалент може да бъде идентифициран въз основа на последователно оцветяване с помощта на Q- и C-техниките (Hulten, 1974). Според Hulten (1974), средната честота на хиазми в отделните автозоми е пропорционална на дължината на хромозомата. Не се влияе от числени или структурни аномалии в други хромозоми. Очевидно хиазмите се образуват в определени области на всяка хромозома. Изясняването на броя и локализацията на хиазмите във всяка хромозома е важно при тяхното генетично картографиране.

Идентифициране на хромозомни аномалии.Феноменът на конюгиране на хомоложни хромозоми в мейозата се използва за идентифициране на много хромозомни пренареждания, които засягат линейната структура на хромозомата. Изтривания, вмъквания, инверсии, реципрочни транслокации, дублации водят до промяна в конфигурацията на бивалента. Възникват едновалентни, тривалентни и др. В комбинация с анализа на митотичните хромозоми, изследването на морфологията на мейотичните хромозоми в пахитена, диакинезата и метафаза I се извършва многократно в случаи на числени или структурни промени в автозомите, половите хромозоми при мъжете с безплодие (AA Prokofieva-Belgovskaya и V.K. Bordzhadze, 1971; Kjessler, 1966; Hulten, 1974 и др.). Субмикроскопската или надмолекулната организация на хромозомния апарат е проучена доста недостатъчно. Докато сега е натрупана обширна информация за структурата на хромозомата на ниво светлинна микроскопия и за молекулярната структура на наследствения материал, междинните стъпки в ултраструктурната организация на хромозомата остават до голяма степен неизвестни. Засега липсват реални предпоставки за поставяне на въпроса за възможните специфики на ултраструктурната организация на човешкия генетичен апарат.

Най-ценната информация за фината структура на функциониращите хромозоми идва от изследването на политените хромозоми, които са специфичен, но естествен модел на хромозомите на интерфазното ядро ​​в клетките на двукрилите, и хромозомите „лампа четка“, открити в ооцитите на земноводни в мейотичните профаза I. Големият размер на тези хромозоми направи възможно тяхното внимателно изследване под светлинен микроскоп. В резултат на тези изследвания бяха формулирани разпоредби, които се считат за основни за организацията на еукариотните хромозоми като цяло (I. I. Kiknadze, 1972).

В интерфазното ядро ​​хромозомните области, съответстващи на еухроматина, имат хромомерна структура. Всеки хромомер е структурна и функционална единица на хромозомата като надлъжно диференцирана органела. Диференциалната транскрипция на тези единици се осигурява структурно чрез декондензация на дезоксирибонуклеопротеина, опакован в него, който се изразява под формата на пуфове в политени хромозоми или бримки в хромозоми с лампа четка.

Методът за изследване на фината структура на интерфазните ядра, които нямат политени хромозоми, както и метафазни хромозоми, е електронната микроскопия (Ю. С. Ченцов, В. Ю. Поляков, 1974). За съжаление, въз основа на резултатите, получени по този метод, все още не е възможно да се формира пълна картина на ултраструктурата на интерфазното ядро. При електронно дифракционни модели на ултратънки участъци основната откриваема морфологична единица е нишка в различни участъци с диаметър 10 nm или по-малко. Върху препарати от хроматин, разпръснати по повърхността на водния менискус, се откриват удължени нишки с диаметър около 23–25 nm.

Въпреки многобройните изследвания на митотични или мейотични хромозоми, данните за тяхната ултраструктура, които биха позволили да се създаде последователен модел за опаковане на елементарна хромозомна нишка по време на клетъчното делене, остават оскъдни. Най-голяма информация е получена за ултраструктурата на специализираните области на хромозомите: центромерната област, ядрото, синаптонемния комплекс в мейотичните хромозоми. За идентифицирането им са използвани данни от електронна микроскопия на цели изолирани хромозоми, като се обръща специално внимание на човешките метафазни хромозоми (Bahr and Larsen, 1974). Този метод позволи да се открие неравномерна плътност на опаковане на елементарни хромозомни нишки по дължината на хромозомите и моделът на тази неравномерност се оказа, че съвпада с линейната диференциация на структурата на хромозомите, която се разкрива под светлинен микроскоп. Елементарните фибрили върху моделите на електронна дифракция на цели разпръснати хромозоми имат размер около 25-30 nm. Биохимично изследване на такива фибрили и съответните изчисления дават основание да се заключи, че нуклеопротеиновите молекули в тях са в свръхусукано състояние и че освен хистони, фибрилите съдържат и други протеини.

Достатъчно пълното отразяване на въпросите на молекулярната генетика и организацията на хромозомите в множество специални монографии и ръководства (S. E. Bresler, 1973; I. P. Ashmarin, 1974; G. Stent, 1974 и др.) изключва необходимостта от подробно разглеждане на тези въпроси в тази Книга. Сравнително нов молекулен аспект на хромозомната организация възниква във връзка с разработването на методи за фракциониране на общата ДНК на генома по честотата на подобни нуклеотидни последователности и методи за хибридизиране на нуклеинови киселини върху хромозомни препарати. Тези методи откриха възможността за изясняване на локализацията на различни ДНК фракции в хромозомния набор. Важни открития, направени в тази нова област, граничеща между молекулярната и цитологичната генетика, бяха: а) откриването в еукариотния геном, в допълнение към ДНК с уникални последователности, на голяма част от ДНК със същите или подобни нуклеотидни последователности, повтарящи се много стотици и хиляди пъти (Г. П. Георгиев, 1973; С. А. Лимборская, 1975); б) откриване на неравномерна локализация на ДНК с различни характеристики в хромозомния набор: ДНК с най-голям брой повтарящи се последователности е локализирана в хетерохроматичните области на хромозомите.

Към днешна дата фракционирането на ДНК и определянето на хромозомната локализация на фракциите са извършени при много видове организми. Всеки вид се характеризира със своята специфична структура на генома по отношение на състава на ДНК и спецификата на тяхното разпределение върху хромозомите на набора. Много работи в тази посока са извършени върху човешки клетки. Резултатите, получени в тях, са обобщени от A. F. Zakharov (1977) и Jones (1973).

ДНК на човешкия геном може да бъде фракционирана на ДНК с уникални копия (около 64%) и ДНК с повтарящи се последователности. Според скоростта на ренатурация, която отразява повторяемостта на нуклеотидните последователности, последната фракция може да бъде разделена на ДНК с ниска (13,4%), междинна (12,3%) и висока (10,3%) скорост на ренатуриране на ДНК молекули. Така около 10% от цялата ДНК в човешкия геном има висока честота на повторение на идентични последователности.

Използвайки градиентно ултрацентрофугиране, най-малко четири вида така наречени сателитни ДНК бяха изолирани от група от силно повтарящи се ДНК. В допълнение към тези видове ДНК, в експерименти с ДНК-РНК хибридизация е изследвана хромозомната локализация на ДНК, кодираща синтеза на 5S, 18S и 28S рибозомни РНК. Понастоящем разпределението на различните видове ДНК в човешките хромозоми е както следва.

ДНК с ниска и средна повторяемост на нуклеотидните копия се намира във всички хромозоми и е локализирана по цялата дължина на техните рамена.

ДНК с висока честота на нуклеотидни копия се намира главно в перицентромерни и частично теломерни области. Сателитните индивидуални ДНК са неравномерно разпределени в различни хромозоми. Така Y-хромозомата е особено богата на сателитна ДНК I и IV, хромозоми 1 и 16 съдържат най-много сателитна ДНК II, а хромозома 9 - III. Рибозомната ДНК 18S и 28S се съдържа почти изключително в късите рамена на всичките 10 акроцентрични хромозоми. Дисталната част на дългото рамо на автозома 1 е предпочитано място за пистрони, кодиращи 5S РНК. Възможно е методът на ДНК-РНК хибридизация in situ да може да картографира не само полигенни локуси, но и структурни гени, които се повтарят малък брой пъти (Rotterdam. Conference, 1974).

Двете най-важни характеристики на генетичната организация на еукариотите - диференциалната активност на структурните гени и голяма част от гените, които регулират този процес - трябва да се основават на съответната структурна организация на хромозомата. Десетилетия упорита работа на цитогенетиците ни доближиха днес много по-близо до разбирането как структурата и функцията си взаимодействат в хромозомата, как хромозомата изпълнява своята сложна роля за интегриране на генната система.

Първата основна характеристика на структурната и функционална организация на хромозомата е съществуването на два различни функционални типа хромозомен материал - еухроматин и хетерохроматин.Основната им разлика е в транскрипционната активност.

Липсата на генетична активност в хетерохроматина се дължи или на липсата на структурни гени (структурен хетерохроматин), или на временното изключване на хромозомната област, носеща такива гени, от генетичната транскрипция (факултативен хетерохроматин, хетерохроматинизация).

Втората най-важна характеристика на хромозомната организация е линейната дисекция на хромозомата на участъци, състоящи се от различни видове хроматин. Всяка хромозома се отличава със своето уникално подреждане на хетеро- и еухроматични области.

Подразделянето на хроматина според генетичното значение корелира добре с разликата в типовете хроматин и според редица други характеристики: състоянието на кондензация в интерфазното ядро ​​и хронологията на кондензацията в митотичния и мейотичния цикъл; време за репликация на ДНК;

във връзка с оцветяване с флуорохроми или нефлуоресцентни багрила; чувствителност към увреждащия ефект на химически мутагени; химични характеристики на ДНК и, очевидно, протеини, които изграждат хроматина; фенотипни прояви на хромозомни пренареждания. Хетерохроматинът се характеризира с кондензирано състояние в интерфазното ядро, напреднала кондензация в профазата на митозата и мейозата и способността да изостава в кондензацията спонтанно или под влияние на определени влияния в метафазата на митозата. В сравнение с еухроматина, хетерохроматичните области на хромозомите се възпроизвеждат в по-късните сегменти на S-периода. При диференциално оцветяване според G- и C-метода, хетерохроматичните сегменти запазват способността си да оцветяват (G-сегменти) и дори интензивно оцветяват (C-сегменти). В цитогенетиката неравномерното разпределение по дължината на хромозомата на нейните структурни увреждания, предизвикани от мутагенни вещества, е добре известно: именно хетерохроматиновите участъци се характеризират с повишено увреждане. ДНК с многократно повтарящи се нуклеотидни последователности е характерна за хетерохроматина. За разлика от еухроматина, който съдържа уникални гени, дисбалансът в който се отразява негативно на фенотипа на организма, промените в количеството на хетерохроматина не влияят или влияят значително по-малко върху развитието на чертите на организма.

Взаимната връзка на различни структурни и функционални характеристики на хромозомата е третата основна характеристика на хромозомната организация. Въпросът за причинно-следствените връзки в отбелязания корелационен комплекс се проучва активно. Трябва да се получи отговор по-специално на въпроса дали цялото разнообразие от свойства на различните видове хроматин може да се сведе до различия в химичните характеристики на хромозомната ДНК. Въпреки това, независимо от напредъка в разбирането на тези корелации, тяхната феноменология служи като основен инструмент за разбиране на структурната и функционална дисекция на всяка конкретна човешка хромозома. При надлъжната диференциация на отделните хромозоми по отношение на плътността на кондензация, оцветяването с определени багрила, по отношение на характеристиките на тяхната ДНК и други характеристики, няма формални признаци за идентифициране на хромозоми или техните региони, а признаци, които имат генетично значение. Тази нова област на човешката цитогенетика е в процес на активно развитие и, съчетана с напредъка в хромозомното картографиране, ще изведе човешката цитогенетика на още по-високо ниво. От вече наличната информация по този проблем, следното представлява интерес за генетиката.

Хетерохроматин, оцветен по метода на C-оцветяване, се намира във всички човешки хромозоми и се нарича структурен хетерохроматин. Във всички автозоми и X хромозомата, тя заема, както в повечето хромозоми на други биологични видове, перицентромерна област. В Y хромозомата тя е локализирана в дисталната част на дългото рамо. В различните хромозоми количеството С-хетерохроматин е различно. Неговите особено големи блокове, простиращи се главно до дълги рамена, се съдържат в автозоми 1, 9 и 16; именно тези региони са известни като най-редовните вторични стеснения. Особено малки блокове от този хроматин се наблюдават в автозома 2 и в X хромозомата. В акроцентричните хромозоми хетерохроматинът се простира до къси рамена.

Очевидно циркумцентромерният хетерохроматин не е еднакъв в различните хромозоми, което следва от редица факти. Тази хетерогенност вече се разкрива от различното оптимално време и рН на алкалния диапазон, използван в техниката за оцветяване с С, при която С-хроматин се появява в различни хромозоми. Хетерогенността е особено демонстративна при оцветяване на хромозоми с акрихин или акрихинова горчица: С-хетерохроматинът на автозоми 1, 9 и 16 изобщо не флуоресцира, докато хетерохроматинът на автозоми 3, 4, акроцентрични хромозоми и Y хромозомата свети изключително ярко . Генетичното значение на хетерогенността на човешкия С-хетерохроматин все още не е ясно. Химическата основа на тази хетерогенност започва да става ясна. Експерименти с хибридизация на ДНК с РНК върху цитологични препарати установиха, че разликите в хетерохроматина на различни човешки хромозоми могат да бъдат свързани с особеностите на структурата на ДНК. Във всички случаи това е ДНК с повтарящи се нуклеотидни последователности, но различните хромозоми очевидно съдържат различни класове ДНК. Така от добре характеризираните сателитни ДНК сателити I и IV се намират в голям брой в Y хромозомата, сателит II се намира в автозомен хетерохроматин 1 и 16, а сателит III се намира в автозомен хетерохроматин 9. Структурен хетерохроматин на акроцентричните хромозоми е основният носител на рибозомната ДНК.

В пълно съответствие с данните на общата цитогенетика за слабия отрицателен ефект на дисбаланса в хетерохроматичния материал върху развитието на организма, има данни за наличието на значителен полиморфизъм в човешката популация, дължащ се на размера на перицентромерния хетерохроматин. Съдържанието на С-тип структурен хетерохроматин варира особено силно в автозомите 1, 4, 9, 13-15, 16, 21-22 и Y-хромозомата. Отсъствието на фенотипни отклонения от нормата при повечето носители на такива кариотипни варианти ни позволява да ги разглеждаме като варианти на нормата. Този проблем обаче беше поставен на дневен ред съвсем наскоро. Изисква задълбочено изследване върху голям популационен материал, преди да се очертаят разумни граници на хромозомната норма, отвъд които дисбалансът на хетерохроматина става небезразличен за организма.

Има много причини да се разглеждат хромозомните области, оцветени положително по G-метода, като вид структурен хетерохроматин. В допълнение към връзката им с багрилата, тази идея се подкрепя от късната репликация на тези региони, образуването на хромомери от тях в профазните мейотични хромозоми и способността да изостават в митотична кондензация под въздействието на 5-бромодеоксиуридин или студ. Важно е да се отбележи, че дисбалансът в автозомите, особено богат на G-оцветяващ хроматин, води до появата на най-малко тежките аномалии в развитието на индивида - носител на такъв дисбаланс. Така към тази категория хромозомни аномалии принадлежат тризомии 13, 18 и 21. Има също сведения, че ДНК със средно повторение на идентични нуклеотидни последователности е локализирана в G-оцветяващи сегменти на хромозомите.

Въпросите, пред които е изправена човешката цитогенетика по отношение на структурата, локализацията и особено генетичното значение на структурния хетерохроматин, са сравнително нови.

Напредъкът в тяхното разрешаване не може да бъде отделен от напредъка в дешифрирането на природата на хетерохроматина в еукариотите като цяло.

В допълнение към структурния хетерохроматин има факултативен хетерохроматин, чиято поява в хромозомата се дължи на хетерохроматинизацията на еухроматични области при специални условия. Има надеждни доказателства за съществуването на това явление в човешките хромозоми на примера на генетична инактивация на една от Х хромозомите в соматичните клетки на жената. При хората и други бозайници това е специален случай на явление, открито за първи път в Drosophila от Мюлер през 1932 г. и наречено „компенсация на дозата на гена“. За бозайниците същността му се крие в еволюционно формирания механизъм на инактивиране на втората доза гени, локализирани в X хромозомата, поради което въпреки неравния брой X хромозоми, мъжките и женските организми са равни по броя на функциониращите гени .

Формулирана от Лион (1961, 1974), съответната хипотеза, получила нейното име, се състои от три основни положения:

1. В соматичните клетки на нормално женско тяло една от двете Х хромозоми е инактивирана.

2. В различни клетки на тялото, майчината или бащината Х хромозома е инактивирана.

3. Инактивирането настъпва в ранния ембрионален период и се задържа постоянно от тази Х хромозома в клетъчните поколения.

Хипотезата на Лион се основава на голям брой генетични и цитологични факти, включително тези, получени при хора, които непрекъснато се актуализират през годините от нейното номиниране и информация за които може да се намери в редица прегледи (А. Ф. Захаров, 1968; Лион, 1972, 1974; Гандра и Браун, 1975 и др.).

Генетичните факти се основават на факта, че две клетъчни популации са открити в хетерозиготи за черти, свързани с Х хромозомата. В единия от тях се проявява действието на майчиния ген на Х-хромозомата, в другия - на бащиния, който е свързан с инактивирането съответно на бащините или майчините алели. Когато формулира своята хипотеза, Лион разчита на случаи на мозаечно оцветяване на козината на мишки, което се дължи на инактивиране в различни части на тялото или на дивия ген, или на неговия мутантен алел. При хората, подробни доказателства за съществуването в тялото на хетерозиготни жени на две популации клетки, всяка от които има един от двата алела на гена, локализиран в X хромозомата, инактивиран, са получени чрез изследване на ефектите на гените за глюкоза -6-фосфат дехидрогеназа, фосфоглицерат киназа, хипоксантин-фосфорибозилтрансфераза, еритроцитни кръвни групи Xg (a), при изследване на Х-свързана агамаглобулинемия и мукополизахаридоза (синдром на Хънтър), хемофилия. При хетерозиготи за електрофоретични варианти на глюкозо-6-фосфат дехидрогеназа е потвърдено, че човешката Х хромозома е инактивирана в ранния ембрионален период (Migeon and Kennedy, 1975). Тези констатации трябва да се имат предвид при интерпретирането на данни за Х-свързани наследствени заболявания, особено при монозиготни близнаци.

Цитологичните доказателства в полза на хипотезата на Лион също са много силни, тъй като в нормалните женски соматични клетки една от двете Х хромозоми съответства на характеристиките на хетерохроматинизирана хромозома. В интерфазното ядро ​​се намира под формата на така нареченото тяло на Бар (X-хроматин) - плътно кондензирана, интензивно оцветена бучка хроматин. В профаза тази хромозома изпреварва своя хомолог, втората X хромозома, в цикъла на кондензация. При условия на експериментално излагане на студ или 5-бромодеоксиуридин, една от Х хромозомите изостава значително в кондензацията, не се различава в това отношение от структурния хетерохроматин на автозоми 1, 9, 16 и Y хромозома. Втората Х хромозома е една от най-забавените в началото и края на репликацията на ДНК.

Изследване на множество случаи на аномалии в X-хромозомната система при хора показва, че феноменът на компенсация на генната доза се прилага и за всички случаи на нарушения в броя на X хромозомите, оставяйки само една X хромозома в активно състояние в соматичната клетка . Особено демонстративни в това отношение са Х-полизомията, когато броят на инактивираните Х хромозоми е равен на броя на присъстващите в клетката минус една генетично функционираща.

Както беше показано по-горе, информацията за човешкия кариотип непрекъснато се задълбочава и все повече изследвания се извършват на молекулярно ниво. Цитологичното изследване на материалните основи на човешката наследственост е добре допълнено от генетичния анализ на отделни черти.

Глава 3. Цитогенетичен метод.

В човешката генетика се използват разнообразни изследователски методи, които се използват и в други раздели на биологията – генетика, физиология, цитология, биохимия и пр. Антропогенетиката има и свои методи на изследване: цитогенетични, близнаци, генеалогични и т.н.

Постиженията в молекулярната биология и биохимията имат голям принос за развитието на генетиката. Понастоящем биохимичните и молекулярно-генетичните методи за изследване играят водеща роля в човешката генетика и медицинската генетика. Въпреки това, класическите методи на човешката генетика, като цитогенетични, генеалогични и близнаци, са от голямо значение в момента, особено по въпросите на диагностиката, медико-генетичното консултиране и прогнозата на потомството.

Нека се запознаем с възможностите на цитогенетичния метод.

Същността на този метод е да се изследва структурата на отделните хромозоми, както и характеристиките на набора от хромозоми на човешки клетки в нормални и патологични състояния. Лимфоцитите, букалните епителни клетки и други клетки, които са лесни за получаване, култивиране и подлежащи на кариологичен анализ, служат като удобен обект за това. Това е важен метод за определяне на пола и хромозомните наследствени заболявания на човек.

Основата на цитогенетичния метод е изследването на морфологията на отделните хромозоми на човешките клетки. Съвременният етап на разбиране на структурата на хромозомите се характеризира със създаването на молекулярни модели на тези най-важни структури на ядрото, изследване на ролята на отделните компоненти на хромозомите при съхранението и предаването на наследствена информация.

В Глава 1 разгледахме компонентите на хромозомите като протеини и нуклеинови киселини. Тук се спираме накратко върху структурата и морфологията на хромозомите.

Структурата на хромозомите.

Хромозомната теория за наследствеността е създадена от американския учен Т. Г. Морган. След провеждане на голям брой изследвания върху плодовата муха Drosophila, Морган и неговите ученици откриват, че именно в хромозомите са локализирани наследствените фактори, открити от Мендел, които се наричат ​​гени. Т. Морган и неговите ученици показват, че гените са подредени линейно по дължината на хромозомата.

След като се доказа, че хромозомите са основните генофори (носители на гени), започва периодът на тяхното най-интензивно изследване. Напредъкът в молекулярната биология и генетиката направи възможно да се разберат някои модели в структурата и функционирането на хромозомите в прокариотите и еукариотите, но много остава неизвестно тук. През последните години хромозомите на еукариотите, особено на хората, станаха обект на изследване от различни специалисти, от генетици до физици.


Вече е установено, че структурата на хромозомата се основава на хроматин - сложен комплекс от ДНК, протеини, РНК и други вещества, които изграждат хромозомата (структурата на хроматина разгледахме подробно в Глава 1). Предполага се, че човешката хромозома включва една гигантска молекула ДНК, молекули РНК, хистони и киселинни протеини, различни ензими, фосфолипиди, Ca 2+, Mg 2+ метали и някои други вещества. Методът за подреждане и взаимното подреждане на молекулите на тези химични съединения в хромозомата все още не е известен. Дълга верига ДНК не може да бъде подредена на случаен принцип върху хромозома. Има предположение, че ДНК веригата е опакована по редовен начин и е свързана с протеини.

F. Arrighi и съавтори (1971) установяват, че уникалните последователности заемат повече от 56% от ДНК на човешките хромозоми, силно повтарящи се - 12,4%, междинни повторения - 8%. Общият брой на повтарящите се гени в ДНК на човешката хромозома е 28%. Броят на хромозомите при хората дълго време остава неясен. Факт е, че беше трудно да се определи броят на хромозомите при бозайниците, особено при хората. Хромозомите бяха малки, много много, трудни за преброяване. Когато клетките се фиксират, те се сливат в бучки, което затруднява определянето на истинския брой хромозоми. Следователно първите изследователи не са могли точно и правилно да изчислят броя на хромозомите в човешките клетки. Наречен е различен брой хромозоми - от 44 до 50.

Обикновено хромозомите в клетките се наблюдават по време на митоза на етапа на метафазната плоча. В интерфазното ядро ​​хромозомите не се виждат под светлинен микроскоп. През 1912 г. G. Winivarter, изучавайки хромозомите в сперматогониите и оогонията на човешките гонади, отстранени по време на операцията, установява, че мъжкият набор от хромозоми (кариотип) съдържа 47 хромозоми, а женският - 48. През 1922 г. T. Пейнтър повтори изследването на Winivarter и установи, че мъжкият и женският кариотип съдържат по 48 хромозоми, но женската се различава от мъжката само по две хромозоми. Жените имат 2 големи полови хромозоми, докато мъжете имат една голяма Х хромозома и една малка К хромозома. През следващите години тази гледна точка беше подкрепена от други учени. P. I. Zhivago и A. G. Andrea (1932) предложиха първата класификация на хромозомите в зависимост от тяхната дължина. Тъй като хромозомите са много близо една до друга и е много трудно да се изследват, през следващите години точният брой на хромозомите при хората е обект на спорове и дискусии. Въпреки това постепенно беше постигнато споразумение между изследователите по този въпрос и в продължение на 30 години повечето цитогенетици вярваха, че при хората диплоидният брой на хромозомите е 48, а хаплоидният брой е 24. Подобрените методи за изследване на хромозомите направиха възможно получаването на повече точна информация за броя на хромозомите в човешките клетки, както и идентифициране на нормални кариотипни аномалии, отговорни за някои деформации. Два метода се оказаха особено ефективни:

1. Третиране на клетъчна култура с алкалоида колхицин, което води до натрупване на делящи се клетки на етап метафаза;

2. Третиране на клетки със слаби солеви разтвори, причиняващи подуване, изправяне на хромозомите, което улеснява тяхното изследване.

През 1956 г. шведските цитолози J. Tiyo и A. Levan приготвят клетъчни култури от белодробни тъкани, взети от абортирани човешки ембриони и с помощта на подобрена техника за обработка на клетките получават необичайно ясни препарати, в които ясно се виждат 46 хромозоми.

Няколко месеца по-късно C. Ford и J. Hammerton в Англия установяват, че диплоидните предшественици на зародишните клетки в тестисите на мъжете (сперматогония) също имат 46 хромозоми, а хаплоидните (сперматоцити от 1-во деление) - по 23 хромозоми.

След това бяха изследвани много клетки от различни човешки органи и тъкани и навсякъде нормалният брой хромозоми се оказа 46.

Женският кариотип се различава от мъжкия само по една полова хромозома. Останалите 22 чифта са еднакви за мъже и жени. Тези 22 двойки хромозоми се наричат ​​автозоми. Нормалният кариотип се състои от 44 автозоми (22 двойки) и две полови хромозоми - XXпри жените и XYпри мъжете, тоест женският кариотип има две големи полови хромозоми, а мъжкият има една голяма и една малка.

В човешките зародишни клетки има единичен (хаплоиден) набор от хромозоми - 23, а в соматичните клетки - двоен (диплоиден) набор - 46. Тези открития стимулират по-нататъшното изследване на хромозомите. Разработени са методи за изследване на хромозоми в култура от лимфоцити от периферна кръв и върху други обекти. Понастоящем хромозомите се изследват сравнително лесно в лимфоцитите на периферната кръв. Венозната кръв се поставя в специална хранителна среда, добавя се фитохемаглутинин, който стимулира деленето на клетките, и се поставя в термостат за 72 часа. 6 часа преди края на инкубацията тук се добавя колхицин, който забавя процеса на клетъчно делене на етапа на метафазната плоча. След това културата се поставя в хипотоничен разтвор на NaCl, в който клетките набъбват, което води до леко разкъсване на черупките на ядрото и преминаване на хромозомите в цитоплазмата. След това препаратите се оцветяват с ядрени багрила, по-специално ацетоорцеин, и се изследват в светлинен микроскоп с потапяне.

Под микроскоп се взема предвид общият брой хромозоми, снима се, след което всяка хромозома се изрязва от снимката с ножица и се залепва върху празен лист хартия в ред, като се започне от най-голямата (първата) хромозома и завършва с най-малката (двадесет втора) и полова Y-хромозома. Луминесцентната техника ви позволява бързо и лесно да провеждате масови изследвания, за да идентифицирате пациенти с различни видове хромозомни аномалии. Наборът от количествени (брой на хромозомите и техните размери) и качествени (морфология на хромозомите) характеристики на диплоиден набор от една клетка се обозначава с термина "кариотип". Структурата на хромозомите се променя в зависимост от етапа на клетъчно делене (профаза, метафаза, анафаза, телофаза).

Още в профазата на митозата може да се види, че хромозомата е образувана от две взаимно преплитащи се нишки с еднакъв диаметър - хроматиди. В метафазата хромозомата вече е спирализирана и двете й хроматиди лежат успоредно, разделени от тясна празнина. Всяка хроматида се състои от две хемихроматиди. В резултат на митозата, хроматидите на майчината хромозома стават сестрински хромозоми, а полухроматидите стават техни хроматиди. Хроматидите се основават на хромонеми - така наречените по-тънки нишки на DNP, състоящи се от протеин и нуклеинови киселини.

В интерфазата (интервалът между две клетъчни деления) хроматинът е тясно свързан с ядрените мембрани и ядрения протеинов матрикс. Той също така образува големи области от деспирализирани нишки на DNP. След това постепенно хроматинът се спирализира, образувайки типична метафаза хромозоми. Размерите им варират от 2 до 10 микрона.

Понастоящем интензивно се изучават структурните особености на автозомите и половите хромозоми (върху клетки от костен мозък, лимфоцити, фибробласти, кожни клетки, регенериращ черен дроб).

Хромозомите съдържат структури, наречени хромомери. Хромомерът е навита част от хромонема. Пространствата между хромомерите са представени от хромонемни нишки. Местоположението на хромомерите на всяка хромозома е строго фиксирано, наследствено определено.

Хромомерът е сравнително голяма генетична единица, сравнима по дължина с хромозомата на E. coli. Структурата и функцията на хромомера е основната загадка на съвременната генетика. Предполага се, че някои хромомери са един генетичен локус, където има един структурен ген и много регулаторни гени. Възможно е няколко структурни гена да се намират в други хромомери.

Хромонемите и хромомерите са заобиколени от неоцветяващо вещество - матрица. Смята се, че матрицата съдържа дезоксирибонуклеинова и рибонуклеинова киселини, протеини.

Някои участъци от хромозоми образуват нуклеоли. Ядрата са повече или по-малко деспирализирани участъци от хромозоми, заобиколени от продукти на генната активност (рибозоми, РНК частици и др.). Тук е синтеза на рибозомна РНК, както и определени етапи от образуването на рибозоми. Той синтезира по-голямата част от РНК на клетката.

В метафазната хромозома се разграничават още няколко образувания: центромер, две рамена на хромозомата, теломери и сателит.

Центромерната (мерос - на гръцки, част) участък на хромозомата е неоцветяващ пробив в хромозомата, видим при подготовката на хромозомите. Центромерът съдържа 2-3 двойки хромомери и има сложна структура. Смята се, че насочва движението на хромозомата при митоза. Нишките на шпиндела са прикрепени към центромерите.

Теломерите - специални структури в краищата на хромозомите - също имат сложна структура. Те съдържат няколко хромомера. Теломерите предотвратяват крайното прикрепване на метафазните хромозоми една към друга. Липсата на теломери прави хромозомата "лепкава" - тя лесно се прикрепя към други фрагменти от хромозоми.

Някои области на хромозомата се наричат ​​еухроматични, докато други се наричат ​​хетерохроматични. Еухроматичните участъци на хромозомите са генетично активни области; те съдържат основния комплекс от функциониращи ядрени гени. Загубата дори на най-малкия фрагмент от еухроматин може да причини смъртта на организма. Хетерохроматичните области на хромозомите обикновено са силно спирализирани и като правило не са генетично активни. Ядреният организатор се намира в хетерохроматина. Загубата дори на значителна част от хетерохроматина често не води до смърт на организма. Хетерохроматичните области на хромозомата се репликират по-късно от еухроматичните области. Трябва да се помни, че еухроматинът и хетерохроматинът не са вещество, а функционално състояние на хромозома.

Ако подредите снимки на хомоложни хромозоми с увеличаване на техния размер, тогава можете да получите така наречената идеограма на кариотипа. По този начин идиограмата е графично представяне на хромозомите. На идиограмата двойките хомолози са подредени в редове в ред на намаляващ размер.

При хората, на идиограма, сред 46 хромозоми, се разграничават три типа хромозоми в зависимост от позицията на центромера в хромозомата:

1. Метацентричен - центромерата заема централна позиция в хромозомата, двете рамена на хромозомата са с почти еднаква дължина;

2. Субметацентричен – центромерът е разположен по-близо до единия край на хромозомата, което води до хромозомни рамена с различна дължина.

Класификация на човешките хромозоми според размера и местоположението на центромера
Група хромозоми Номер на кариотипа Характеристики на хромозомите
A(1) 1,2,3 1 и 3 почти метацентрични и 2 големи субметацентрични
НА 11) 4,5 голям субакроцентричен
C (III) 6-12 средно субметацентричен
A(lV) 13-15 средно акроцентричен
E(V) 16-18 малък субметацентричен
F(VI) 19-20 най-малкият мегацентрик
G(VII) 21-22 най-малкият акроцентрик
Х хромозома (принадлежи към група III 23 средно почти метацентричен
Y хромозома 23 плитка акроцентрична

3. Акроцентричен – центромерът се намира в края на хромозомата. Едното рамо е много късо, другото е дълго. Хромозомите не са много лесни за разграничаване една от друга. Цитогенетиката, за да обедини методите за идентифициране на хромозоми, на конференция през 1960 г. в Денвър (САЩ) предложи класификация, която взема предвид размера на хромозомите и местоположението на центромерите. Патау през същата година допълва тази класификация и предлага да се разделят хромозомите на 7 групи. Съгласно тази класификация, първата група А включва големи 1, 2 и 3 суб- и акроцентрични хромозоми. Към втората група В - големи субметацентрични двойки 4-5. Третата група С включва средна субакроцентрична (6-12 двойки) и Х хромозома, която се намира между хромозоми 6 и 7 по размер. Група D (четвърта) включва средни акроцентрични хромозоми (13, 14 и 15 двойки). Към група Е (пета) - малки субметацентрични хромозоми (16, 17 и 18 двойки). Към групата Ф(шеста) малка метацентрична (19-та и 20-та двойка) и група G (седма) - най-малките акроцентрични хромозоми (21-ва и 22-ра двойки) и малка акроцентрична полова Y-хромозома (Таблица 4).

Съществуват и други класификации на хромозомите (Лондон, Париж, Чикаго), в които се разработват, конкретизират и допълват разпоредбите на Денвърската класификация, което в крайна сметка улеснява идентифицирането и обозначаването на всяка от човешките хромозоми и техните части.

Акроцентричните хромозоми от група IV (D, 13-15 двойки) и група VII (G, 21-22 двойки) на късото рамо носят малки допълнителни структури, така наречените сателити. В някои случаи тези спътници са причина за адхезията на хромозомите една към друга по време на клетъчното делене в мейозата, което води до неравномерно разпределение на хромозомите. В едната полова клетка има 22 хромозоми, а в другата - 24. Така възникват монозомии и тризомии за една или друга двойка хромозоми. Фрагмент от една хромозома може да се присъедини към хромозома от друга група (например, фрагмент 21 или 22 се присъединява към 13 или 15). Така се получава транслокацията. Тризомията на 21-ва хромозома или транслокацията на нейния фрагмент е причината за болестта на Даун.

В рамките на тези седем групи хромозоми, въз основа само на външни разлики, видими в обикновен микроскоп, е почти невъзможно да се идентифицират хромозоми. Но при обработка на хромозоми на акрихини, освен това и с помощта на редица други методи за оцветяване, те могат да бъдат идентифицирани. Различни

методи за диференциално оцветяване на хромозоми според Q-, G-, C-техниката (A. F. Zakharov, 1973) (фиг. 27). Нека назовем някои методи за идентифициране на отделни човешки хромозоми. Широко се използват различни модификации на т.нар. В.Например методът QF - използване на флуорохроми; QFQ метод - използване на хинакрин; QFH метод - с помощта на специална багрила на фирма "Hext" № 33258, която разкрива повтарящи се последователности от нуклеотиди в ДНК на хромозомите (сателитна ДНК и др.). Модификациите на GT трипсин метода са мощен инструмент за изследване и индивидуално характеризиране на хромозоми. Нека назовем например метода GTG, който включва третиране на хромозоми с оцветяване с трипсин и Giemsa, метод GTL (лечение с трипсин и оцветяване по Leitman).

Известни методи за третиране на хромозоми с ацетатни соли и багрило Giemsa, методи с използване на бариев хидроксид, акридин портокал и др.

Хромозомната ДНК се открива чрез реакцията на Feulgen, оцветяване с метил зелено, акридино оранжево, багрило № 33258 на фирма Hekst. Акридино-оранжевата боя с едноверижна ДНК образува димерни асоциати и дава червена луминесценция, с двойноверижна спирална ДНК образува едномерни асоциати и луминесцира в зелено.

Чрез измерване на интензитета на червената луминесценция може да се прецени броят на свободните места в DNP и хроматина и съотношението зелено - червено луминесценция - функционалната активност на хромозомите.

Хистоните и киселинните протеини на хромозомите се откриват при различно pH чрез оцветяване с бромфенодно синьо, силно зелено, сребристо, имунолуминесцентен метод, РНК оцветяване с халуцианин стипца, Hext багрило № 1, акридино оранжево при нагряване до 60°.

Широко се използват електронна микроскопия, хистоавторадиография и редица други методи.

През 1969 г. шведският биолог Т. Касперсон и неговите сътрудници показват, че хромозомите, оцветени с горчица хинакрин и осветени под микроскоп с най-дългата дължина на вълната от ултравиолетовия спектър, започват да луминесцентират, като някои части от хромозомите светят по-ярко, други по-слаби. Причината за това е различният химичен състав на повърхността на хромозомата. През следващите години изследователите откриха, че краищата на човешката Y хромозома светят по-ярко от всяка друга човешка хромозома, което прави Y хромозомата лесно забележима на слайд.

Акрихиниприт преференциално се свързва с GC-двойки ДНК. Отделни дискове с хетерохроматични области флуоресцират. Премахнете ДНК - сиянието изчезва. Съставени са карти на флуоресцентни хромозоми. От 27-те вида бозайници само хората, шимпанзетата, горилите и орангутаните имат светещи Y хромозоми. Сиянието е свързано с повторения на гени, които се появяват в еволюцията преди 20 милиона години.

И така, нормално в човешките соматични клетки има 46 хромозоми (23 двойки), а в половите клетки - 23 хромозоми, по една хромозома от всяка двойка. Когато сперма и яйцеклетка се слеят, броят на хромозомите в зиготата се удвоява. По този начин всяка соматична клетка на човешкото тяло съдържа един набор бащински хромозоми и един набор от майчини хромозоми. Ако човек има 46 хромозоми, тогава при различните маймуни броят на хромозомите е 34, 42, 44, 54, 60, 66.

Под действието на ултразвук или високо налягане е възможно ДНК нишките, които изграждат хромозомата, да бъдат разбити на отделни фрагменти. Чрез нагряване на ДНК разтвори до температура 80-100°,

можете да предизвикате денатурация на ДНК, разминаването на двете вериги, които я изграждат. При определени условия, разединените ДНК вериги могат да се асоциират отново в стабилна двуверижна ДНК молекула (реасоциация или ренатурация на ДНК). Денатурация и ренатурация на ДНК могат да бъдат получени и върху препарати от фиксирани хромозоми, като се обработват съответно. Ако след това хромозомите се оцветят с багрилото Giemsa, тогава в тях се разкрива ясна напречна ивица, състояща се от светли и тъмни ивици. Местоположението на тези ленти на всяка хромозома е различно. По този начин дисковете на Giemsa могат също да идентифицират всяка от 23-те двойки хромозоми.

Тези и други методи, особено хибридизацията на соматични клетки на различни животни и хора, се използват за картографиране на хромозоми, т.е. за определяне на позицията на различни гени в една или друга хромозома. Понастоящем около 200 гена са картографирани в човешки автозоми и полови хромозоми.

В края на 1975 г. в различни човешки хромозоми се локализира следният брой гени (А. Ф. Захаров, 1977): 1 хромозома - 24 гена; 2 хромозоми - 10, 3-2, 4-3, 5-3, 6-14, 7-4, 8-1, 9-8, 10-5, 11-4, 12-10, 13-3, 14 -3, 15-6, 16-4, 17-14, 18-1, 19-4, 20-3, 21-4, 22-1; Y-хромозома - 2; Х хромозома - 95 гена.

Глава 4. Полов хроматин.

През 1949 г. M. Barr и C. Bertram, изучавайки невроните на котките, обръщат внимание на факта, че интерфазното клетъчно ядро ​​съдържа силно оцветено тяло и то присъства само в ядрата на женските клетки и липсва при мъжете. Намира се при много животни и винаги само при женски. Това малко тяло се нарича полов хроматин или тяло на Бар. При редица гръбначни животни и при хората се появява в ранна онтогенеза на етап гаструла, но преди развитието на половите жлези (половите жлези). Местоположението, формата и структурата на половия хроматин не се влияят от половите хормони, следователно не е вторична полова характеристика. Между броя на телата на половия хроматин и броя Х-хромозомите в ядрото са директно свързани. Половият хроматин в интерфазните ядра се дължи на спирализацията на една от Х хромозомите, чието инактивиране е механизъм, който изравнява баланса на гените на половите хромозоми в клетките на мъжките и женските (т.е. това е един от механизмите за дозиране). компенсация на гените).

През 1961 г. няколко изследователи едновременно предполагат, че една от Х хромозомите при нормални жени е относително неактивна генетично. През 1961 г. английският изследовател М. Лион излага хипотеза за механизмите на инактивиране на една от Х хромозомите в клетките на женското тяло. Основните точки на тази хипотеза са както следва:

1. Една от двете Х-хромозоми на клетките на жената е неактивна.

2. Една неактивна хромозома може да бъде от бащиния или от майчиния организъм.

3. Инактивирането настъпва в ранната ембриогенеза и продължава по време на по-нататъшно възпроизвеждане и развитие на клетъчната линия. Този процес на инактивиране на Х-хромозомата е обратим в редица поколения:

XX*->- уау ->XX*и т.н. (тук звездичката обозначава спираловидната X хромозома). Португалският генетик Сера предложи този тип обратими промени в генетичния материал да се нарече трепция (от гръцки treptos - промяна).

Спирализираната Х хромозома в клетката образува половия хроматин или тялото на Бар. Ако жените имат няколко X хромозоми в клетъчното ядро, тогава в клетките има няколко тела на Barr, само една X хромозома остава активна. Х хромозомата не е напълно инактивирана, част от късото рамо остава генетично активна. Инактивирането на Х хромозомата до известна степен зависи от етапа на клетъчния цикъл и физиологичното състояние на организма. При наличие на излишък или липса на тяло на Бар могат да се диагностицират някои видове наследствени заболявания (например синдром на Клайнфелтер, синдром на Шерешевски-Търнър). Клетки, които не съдържат полов хроматин (хроматин-отрицателни клетки), се намират при индивиди с набор от хромозоми 45, XO (синдром на Шерешевски-Търнър);

46,XY(нормални мъже); 47, XYY(синдром на Клайнфелтер с две Y хромозоми). Обикновено в клетките на нормално мъжко тяло се откриват определен брой псевдотела на Бар (кондензирани участъци от автозоми) и спираловидни Y хромозоми, следователно при диагностициране на различни хромозомни заболявания е необходимо да можете да разграничите тези образувания от типичен полов хроматин, образуван от спирализирана допълнителна X хромозома. Тялото на Бар се намира при хромозомен набор 46,XX (нормални жени); 47,XXY и 48,XXYU (класически синдром на Клайнфелтер). Две тела на Бар се намират в човек с три Х хромозоми, (47, XXX); три X хромозоми и една Y (48, XXXY, синдром на Клайнфелтер); 49, XXXXY (синдром на Клайнфелтер). Три тела на Бар се срещат при 48, XXXX и 49, XXXXY кариотипи (тежък синдром на Клайнфелтер).

В полиплоидните клетки броят на телата на половия хроматин съответства на плоидността. Според формулата на Гарднър, броят на телата на Бар (B)

равно на B = X - , където Х -броя на Х хромозомите, R -клетъчна плоидност. В неполиплоидни клетки броят на телата на половия хроматин е равен на броя на Х хромозомите минус една. (В = Х - 1).

Структурни промени в хромозомите

Хромозомите могат да претърпят различни структурни промени. Особено важни са загубата на отделни фрагменти от хромозоми (разделяне) или прехвърлянето на участък от една хромозома в друга (транслокация). Транслокацията се обозначава с латинската буква /, в скоби до нея се изписва индексът на групата или номерът на донорната хромозома, обозначението на прехвърленото място. Същите обозначения са посочени за хромозомата на реципиента, например 46, XXt (ср+ + B4 q-). Букви в скоби РИ qпоказват хромозомните рамена, засегнати от транслокацията. Късото рамо на хромозомата се обозначава с буквата R,дълго писмо q,сателитът се обозначава с буквата s и т.н. Увеличаването на дължината на ръката се обозначава със знак плюс, а намаляването със знак минус (и двете се поставят след символа на хромозомата).

Появата на една допълнителна хромозома в кариотипа води до тризомия. Многократното увеличаване на броя на всички хромозоми се нарича полиплоидия (може да има триплоиди, тетраплоиди и др.). Загубата на една от двойка хомоложни хромозоми води до състояние, наречено монозомия. Промените в броя или структурата на хромозомите се наричат ​​хромозомни аберации.

Нека разгледаме най-честите видове структурни нарушения на хромозомите - делеции и транслокации. С делеция общият брой на хромозомите не се променя. Въпреки това, в някои хромозоми липсва генетичен материал, което причинява различни промени във фенотипа. Най-честата делеция е 5-та и 18-та автозома и Х-хромозомата. Делециите водят до развитие на различни наследствени заболявания и синдроми.

През 1963 г. J. Lejeune описва синдрома на "котешкия вик". Плачът на такива деца наподобява „мяукането на котка“. Децата имат рязко недоразвитие на ларинкса, кръгло лице с форма на луна, микроцефалия, микрогнатия, монголоиден разрез на очите, ниско разположени деформирани ушни миди, мускулна хипотония и леки вторични полови белези. Тези деца са с умствена изостаналост. В кариотипа на децата се забелязва делеция на късото рамо на 5-та двойка хромозоми.

Разделянето на дългите и късите рамена на 18-та хромозома е придружено от различни структурни нарушения на лицето, скелета и вътрешните органи. Децата имат умствена изостаналост, недохранване, хипотония, микроцефалия, недоразвитие на лицето, нисък груб глас, недоразвитие на външните полови органи, средното ухо, атрезия на външния слухов проход и други аномалии.

При изтриване на късото рамо на 18-та хромозома пациентите имат и различни дефекти в скелета, вътрешните органи и умствена изостаналост.

Изтриването на късото рамо на Х хромозомата може да се интерпретира като частична монозомия на Х хромозомата. Описан при жени със забавяне на растежа, недоразвитие на яйчниците без тежки соматични аномалии. Въпреки че в тях се открива полов хроматин, размерът му е много по-малък от нормалния.

При хронична миелоидна левкемия се забелязва скъсяване на късото рамо на 21-ва хромозома (т.нар. Филаделфийска хромозома). Тази хромозома обаче се намира само в кръвните клетки и точката на костния мозък. Други клетки имат нормален кариотип.

В резултат на два крайни недостига, последвани от свързване на счупени краища, се образуват пръстенни хромозоми. Следователно това нарушение на структурата на хромозомите всъщност е специален случай на делеция. Клиничната картина на пациентите - носители на пръстенни хромозоми - наподобява тази на делеция на съответната хромозома. И така, с пръстенната хромозома от група В (5-та двойка) се развива клиничната картина на синдрома на "котешкия вик", а с пръстенната X хромозома клиничната картина е близка до синдрома на Шерешевски-Търнър.

Транслокациите са структурни пренареждания, при които се обменя генетичен материал между хромозомите. Възможни са различни видове транслокации: реципрочни, при които има взаимен обмен на фрагменти; нереципрочни, когато генетичният материал на една хромозома се прехвърля в друга, и накрая центрични връзки. Последните транслокации между акроцентричните хромозоми са най-чести. В този случай се губи само малък фрагмент от късите рамена на акроцентричните хромозоми. Повечето от тези пренареждания могат да се считат за балансирани, тъй като не причиняват сериозни отклонения във фенотипа на носителя на транслокация. Въпреки това, потомството на такива носители има клинично изразени дефекти, характерни за анормален набор от хромозоми.

Известно е, че болестта на Даун може да се наблюдава както при тризомия на 21-та автозома, така и при транслокация на фрагмент от тази хромозома в други. Такива пациенти имат 46 хромозоми, но една от хромозомите всъщност е двойна, тъй като фрагмент от 21-ва хромозома все още е прикрепен към нея и в резултат на това такова пренареждане се оказва небалансирано. При родителите на тези пациенти кариотипът включва 45 хромозоми, но една от хромозомите всъщност е двойна (с транслокация). Когато яйцеклетка, съдържаща тази хромозома, бъде оплодена, нормалната сперма в зиготата всъщност ще има три 21-ви хромозоми, което фенотипно се проявява от болестта на Даун.

21-вата хромозома най-често се премества в 15-та или друга хромозома от D групата (13-та, 14-та) при жените или в 22-та при мъжете. В този случай младите здрави родители може да имат дете с болестта на Даун, за разлика от тризомия 21, която се среща по-често при деца, родени от възрастни майки. Практически е невъзможно да се определи наличието на транслокация при индивид преди раждането на дете с болестта на Даун, без да се изследва кариотипа, тъй като фенотипът на тези носители се различава малко от фенотипа на индивиди с нормални генотипове. Следователно във всички тези случаи изследването на кариотипа е от особено значение.

Механизмът на развитие на болестта на Даун по време на транслокация при един от родителите може да бъде представен по следния начин. При транслокация кариотипът на индивида се състои от 45 хромозоми, тъй като една хромозома е увеличена. Транслокацията засяга всички клетки, включително оогония и сперматогония. При образуването на зародишни клетки (гамети) в едната гамета попадат 23 хромозоми, а в другата – 22. Но преместената хромозома може да се окаже както в гамета с 22 хромозоми, така и в гамета с 23 хромозоми. Така теоретично са възможни 4 варианта на гамети: 23 нормални хромозоми, 23 с транслокация, 22 нормални хромозоми и 22 с транслокация. Ако транслокацията се обозначи с апостроф, тогава ще се получи следната поредица от гамети: 23 23 1 22 22 1 .

Ако тези гамети са оплодени от нормална гамета от противоположния пол, тогава получаваме следните комбинации: 1) 23 + 23 = 46 хромозоми (нормален кариотип); 2) 23 1 + 23 = 46 1 хромозоми, но всъщност 47 хромозоми (в този случай ще се развие болестта на Даун); 3) 22 + 23 = 45 хромозоми (такава зигота не е жизнеспособна и умира); 4) 22 1 +23 = 45 1 хромозоми (в този случай индивидът се ражда с транслокация, като един от родителите му).

Шансовете за раждане на дете с болестта на Даун (с транслокация при един от родителите) са 33%. Това е много голям риск и в този случай по-нататъшното раждане не е желателно, особено след като съществува риск от транслокация при внуци. Ако дете със синдром на Даун, причинен от тризомия 21, е родено от родители с нормален кариотип, тогава шансовете за раждане на същото дете отново са много малки. Въпреки това, не във всички случаи при раждане на дете с болестта на Даун поради транслокацията на 21-ва хромозома, транслокацията присъства в соматичните клетки на майката. При около половината от майките кариотипът е нормален, а транслокацията е настъпила по време на мейоза, предшестваща образуването на яйцеклетката, от която се е развил организмът на болното дете.

Глава 5. Мозаицизъм.

Това е състояние, при което клетките с нормални и анормални кариотипи се смесват в тялото, да речем, 46/47 или 46/45. Възниква поради неразпадане на хромозомите в началните етапи на ембрионалното развитие. Мозаицизмът дава изтрити, леки симптоми на заболяването в сравнение с пациенти, които имат променен кариотип във всички клетки. Човек с мозаечен вариант на болестта на Даун може да има само някои от физическите признаци на болестта. Развитието на интелигентността не се нарушава. При мозаицизъм 45XO / 46XX синдромът на Шерешевски-Търнър е по-леко изразен. Тези пациенти могат да развият яйчникова тъкан и да овулират. При кариотипа 46XY/47XXY синдромът на Клайнфелтер е по-леко изразен. Сред пациентите женски и мъжки мозайки с посочените кариотипи са по-чести от „чистите“ случаи на синдром на Шерешевски-Търнър или синдром на Клайнфелтер. С възрастта клонингът на анормалните клетки постепенно се елиминира и поради това е трудно да се установи мозаицизъм в напреднала възраст, въпреки че в ембрионалния и ранния постембрионален период той е бил достатъчно изразен и може да доведе до развитие на фенотипни признаци на заболяването. Колкото по-малко анормални клетки в тялото, толкова по-слаби са признаците на заболяването. Това може да обясни изтритите и рудиментарни форми на тези заболявания.

При кръвни заболявания може да възникне множествено (полиплоидия) или некратно (анеуплоидия) увеличение на броя на хромозомите. Наблюдава се обаче само в кръвните клетки, докато в други соматични клетки кариотипът е нормален.


Списък на използваната литература.

1. Бердишев Г.Д., Криворучко И.Ф. Човешка генетика с основите на медицинската генетика. - Киев: Училище Вища, 1979.

2. Бочков Н.П. Човешка генетика. - Москва, 1973г.

3. Фогел Ф. Мотулски А. Човешка генетика: история на човешката хромозома, формална генетика. Москва: Мир, 1989.

4. Стърн, Кърт Основи на човешката генетика. Москва: Медицина, 1965

5. McKusick V. Човешка генетика. Москва: Мир, 1967.


Човешка генетика с основите на медицинската генетика. Бердишев Г.Д., Криворучко И.Ф. стр.5-21

Човешка генетика: историята на човешката хромозома, формална генетика. Vogel F. Motulsky A. pp.11-19

Човешка генетика: историята на човешката хромозома, формална генетика. Vogel F. Motulsky A. pp.23-31

Човешка генетика. Бочков Н.П. от 44

Човешка генетика. Маккусик. V. стр.10, 13-22

Основи на човешката генетика. Стърн, Кърт. стр.41-60

Човешка генетика. Бочков Н.П. стр.90

Кариотипът е диплоиден набор от хромозоми на даден тип организъм, характеризиращ се с постоянен брой, размер и форма на хромозомите. Човешкият кариотип има 46 хромозоми или 23 двойки. Сдвоените хромозоми се наричат ​​хомоложни, имат еднаква дължина и форма, съдържат алелни гени. Хромозомите са 40% ДНК, 40% хистонови протеини и 20% нехистонови протеини. Комплексът от всички химични вещества, които изграждат хромозомите, се нарича хроматин. Хромозомите могат да бъдат в клетките в две структурни и функционални състояния – спирализирано и деспирализирано. По време на интерфазата те са в деспирализирано състояние. В спирализирано състояние те са в периода на митоза. Максималната спирализация на хромозомата се достига в метафазата на митозата. Метафазната хромозома се състои от две хроматиди, свързани в областта на първичната констрикция (центромера). Някои хромозоми имат вторични стеснения и сателити. Центромерът разделя хроматидата на две рамена. Късото рамо обикновено се обозначава с буквата p, а дългото рамо с буквата q.

Структурата на метафазната хромозома.

втори

свиване п

центромер

През 1960 г. английският генетик Патау предлага да се класифицират човешките хромозоми въз основа на относителната дължина и позиция на центромерата (индекс на центромера). Центромерният индекс е съотношението на дължината на късото рамо към дължината на цялата хромозома. В съответствие с индекса на центромерите се разграничават метацентрични (свиване в средата), субметацентрични (едно рамо е по-дълго от второто) и акроцентрични хромозоми (с непропорционално много късо едно рамо).

метацентричен субметацентричен акроцентричен

През 1960 г. на международния генетичен симпозиум в Денвър (САЩ) е приета Международната (Денвър) класификация на човешките хромозоми. Патау разработи основните принципи на класификацията. Класификацията взема предвид дължината и формата на хромозомите. Всички двойки автозоми са номерирани с арабски цифри от 1 до 22 в низходящ ред на тяхната дължина. Половите хромозоми се обозначават с латинските букви X и Y и се поставят в края на оформлението. Жените обикновено имат XX полови хромозоми, докато мъжете имат XY.

Всички двойки автозоми са разделени на 7 групи в съответствие с дължината и формата на хромозомите. Групите се обозначават с латински букви от A до G. Групите са ясно разграничени една от друга.

Група А(1,2,3 двойки) най-дългите метацентрични (1,3) и субметацентрични (2) хромозоми. Хромозома 1 е най-голямата метацентрична хромозома, центромерът е разположен в средата. Най-голямата субметацентрична хромозома е хромозома 2. Хромозома 3 е почти 20% по-къса от хромозома 1 и следователно лесно се идентифицира. Абсолютна дължина от 11 µm (1 чифт) до 8,3 µm (2 чифта).

Група Б(4 и 5 двойки) дълги субметацентрични хромозоми Те не се различават една от друга без диференцирано оцветяване. Абсолютната дължина е 7,7 µm.

Група C(6 - 12 двойки) Хромозоми със среден размер, субметацентрични. При стандартно (рутинно) оцветяване Х хромозомата не може да бъде разграничена от другите хромозоми в тази група. По размер е подобен на хромозоми 6 и 7. Абсолютна дължина от 7,7 µm (6 двойки) до 5,8 µm.

Групад(13 - 15 двойки) Тези акроцентрични хромозоми са много различни по форма от всички други човешки хромозоми. И трите двойки на късото рамо съдържат сателити. Дължината на проксималните части на късите рамена варира, сателитите може да липсват или да са много големи, да флуоресцират ярко или да не дават флуоресценция. Абсолютна дължина от 4,2 µm.

Група Е(16 - 18 двойки) Относително къси субметацентрични хромозоми. Абсолютната дължина е 3,6-3,5 µm.

ГрупаФ- (19 - 20 двойки) малки метацентрични хромозоми При препарати с рутинно оцветяване те изглеждат еднакви, но при диференциално оцветяване се различават рязко. Абсолютната дължина е 2,9 µm.

Групаг(21 - 22 двойки) - две двойки от най-малките акроцентрични хромозоми. На късото рамо имат сателит. Променливостта на късите им рамена е също толкова значителна, колкото при хромозомите от група D. Абсолютната дължина е 2,9 µm.

Y хромозомата е малка акроцентрична хромозома с дължина 2,8 µm. Обикновено (но не винаги) по-голяма от хромозомите от групата G и хроматидите на нейното дълго рамо са склонни да лежат успоредно една на друга. По това се различава от хромозомите от група G, в които хроматидите на дългите рамена образуват широк ъгъл.

Х хромозомата е подобна при рутинно оцветяване с грипните С хромозоми, но се различава, когато се използва диференцирано оцветяване. X - субметацентрична хромозома, дълга 6,8 µm.

Класификация на хромозомните заболявания.

Досега са описани над 1000 заболявания. Около сто от тях имат ясна клинична картина и се наричат ​​синдроми. Всички хромозомни заболявания могат да бъдат разделени на три групи в зависимост от естеството на промяната в кариотипа.

Хромозомни заболявания.

Полиплоидия Свързани заболявания Свързани заболявания

със смяна на числото и с промяна в броя и

структури на автозомите структури на пола

хромозоми.

В зависимост от процента на засегнатите клетки има пъленхромозомни заболявания и мозайка.Пълните са резултат от генеративна мутация в родителите (т.е. мутациите възникват по време на образуването на зародишни клетки в родителите). Всички ембрионални клетки имат променен кариотип. Мозайките са резултат от соматична мутация, която възниква в самия ембрион по време на ембрионалния период на развитие. Следователно някои от клетките на пациента имат нормален набор от хромозоми, а някои от клетките са променени.

Разпределете също спорадиченхромозомни заболявания (следствие от нова мутация) и наследени(наследени от родители с балансирана мутация или от родители с хромозомно заболяване). Описани са случаи на раждане на деца при пациенти със синдроми на Клайнфелтер, полизомия X при жени, полизомия Y при мъже и жени със синдром на Даун. Мъжете със синдром на Даун са безплодни, защото имат нарушена сперматогенеза.