Introducere

În munca mea, acopăr subiectul ingineriei genetice. Oportunitățile oferite de ingineria genetică pentru umanitate, atât în ​​domeniul științei fundamentale, cât și în multe alte domenii, sunt foarte mari și adesea chiar revoluționare.

Deci, permite producția industrială în masă a proteinelor necesare, facilitează foarte mult procesele tehnologice de obținere a produselor de fermentație - enzime și aminoacizi, în viitor poate fi folosit pentru ameliorarea plantelor și animalelor, precum și pentru tratarea bolilor ereditare ale omului.

Prin urmare, Inginerie genetică fiind una dintre principalele direcții ale progresului științific și tehnologic, contribuie activ la accelerarea soluționării multor probleme, precum alimentație, agricultură, energie, mediu.

Dar ingineria genetică deschide oportunități deosebit de mari pentru medicină și produse farmaceutice, deoarece utilizarea ingineriei genetice poate duce la transformări radicale ale medicinei.

1. Esența ingineriei genetice.

1.1. Istoria ingineriei genetice.

Ingineria genetică a apărut datorită muncii multor cercetători din diverse ramuri ale biochimiei și geneticii moleculare.

De mulți ani, proteinele au fost considerate clasa principală de macromolecule. Exista chiar și presupunerea că genele sunt de natură proteică.

Abia în 1944, Avery, McLeod și McCarthy au arătat că ADN-ul este purtătorul de informații ereditare.

Din acel moment, a început un studiu intensiv al acizilor nucleici. Un deceniu mai târziu, în 1953, J. Watson și F. Crick au creat un model ADN dublu catenar. Anul acesta este considerat a fi anul nașterii biologiei moleculare.

La începutul anilor 50-60, proprietățile codului genetic au fost clarificate, iar la sfârșitul anilor 60 universalitatea sa a fost confirmată experimental.

A existat o dezvoltare intensivă a geneticii moleculare, ale cărei obiecte erau E. coli, virusurile și plasmidele sale.

Au fost dezvoltate metode pentru izolarea preparatelor înalt purificate de molecule de ADN intacte, plasmide și virusuri.

ADN-ul virusurilor și plasmidelor a fost introdus în celule într-o formă biologic activă, asigurând replicarea acestuia și exprimarea genelor corespunzătoare.

În anii '70, au fost descoperite o serie de enzime care catalizează reacțiile de transformare a ADN-ului. Enzimele de restricție și ADN-ligazele joacă un rol deosebit în dezvoltarea metodelor de inginerie genetică.

Istoria dezvoltării ingineriei genetice poate fi împărțită aproximativ în trei etape:

Prima etapă este asociată cu demonstrarea posibilității fundamentale de obținere a moleculelor de ADN recombinant in vitro. Aceste lucrări se referă la producerea de hibrizi între diferite plasmide. S-a demonstrat posibilitatea creării de molecule recombinante folosind molecule originale de ADN din diverse specii și tulpini de bacterii, viabilitatea, stabilitatea și funcționarea acestora.

A doua etapă este asociată cu începerea lucrărilor privind producerea de molecule de ADN recombinant între genele cromozomiale ale procariotelor și diverse plasmide, dovadă a stabilității și viabilității acestora.

A treia etapă este începutul lucrărilor privind includerea genelor eucariote, în principal animale, în moleculele de ADN vector (ADN utilizat pentru transferul de gene și capabil să se integreze în aparatul genetic al celulei primitoare).

Formal, data de naștere a ingineriei genetice ar trebui luată în considerare 1972, când la Universitatea Stanford P. Berg și S. Cohen și colegii lor au creat primul ADN recombinant care conține fragmente de ADN ale virusului SV40, bacteriofagului și E. coli.

1.2. Concept de inginerie genetică

Una dintre ramurile geneticii moleculare și biologiei moleculare, care a găsit cea mai mare aplicație practică, este ingineria genetică.

Ingineria genetică este suma metodelor care permit transferul de gene de la un organism la altul, sau este o tehnologie pentru construirea dirijată a unor noi obiecte biologice.

Născută la începutul anilor 70, ea a obținut un mare succes astăzi. Ingineria genetică transformă celulele bacteriilor, drojdiilor și mamiferelor în „fabrici” pentru producția pe scară largă a oricărei proteine.

Acest lucru face posibilă analiza în detaliu a structurii și funcției proteinelor și utilizarea lor ca medicamente.

În prezent, E. coli (E. coli) a devenit un furnizor de hormoni importanți precum insulina și hormonul de creștere.

Anterior, insulina se obținea din celulele pancreasului animalelor, așa că costul acesteia era foarte mare. Pentru a obține 100 g de insulină cristalină, sunt necesare 800-1000 kg de pancreas, iar o glandă a unei vaci cântărește 200-250 de grame. Acest lucru a făcut ca insulina să fie costisitoare și dificil de obținut pentru o gamă largă de diabetici.

Insulina este formată din două lanțuri polipeptidice, A și B, lungi de 20 și 30 de aminoacizi. Când sunt conectate prin legături disulfurice, se formează insulină nativă dublu catenară.

S-a demonstrat că nu conține proteine ​​E. coli, endotoxine și alte impurități, nu dă efecte secundare precum insulina animală și nu diferă de aceasta în activitatea biologică.

Hormonul de creștere este un hormon de creștere uman secretat de glanda pituitară. Lipsa acestui hormon duce la nanism pituitar. Dacă introduceți somatotropină în doze de 10 mg la 1 kg de greutate corporală de trei ori pe săptămână, atunci într-un an un copil care suferă de deficiența acesteia poate crește cu 6 cm.

Anterior, se obținea din material cadaveric, dintr-un cadavru: 4-6 mg de somatotropină în ceea ce privește preparatul farmaceutic final. Astfel, cantitățile disponibile de hormon erau limitate, în plus, hormonul obținut prin această metodă era eterogen și putea conține viruși cu dezvoltare lentă.

Compania „Genentec” a dezvoltat în 1980 o tehnologie pentru producerea de somatotropină folosind bacterii, care a fost lipsită de dezavantajele enumerate. În 1982, hormonul de creștere uman a fost obținut în cultura de E. coli și celule animale la Institutul Pasteur din Franța, iar în 1984 a început producția industrială de insulină în URSS.

1.3. Scopurile și obiectivele ingineriei genetice

Scopul ingineriei genetice aplicate este de a proiecta astfel de molecule de ADN recombinant care, atunci când sunt introduse în aparatul genetic, ar conferi proprietăți utile oamenilor organismului.

Producerea de sonde de ADN foarte specifice se bazează pe tehnologia ADN-ului recombinant, cu ajutorul căreia expresia genelor în țesuturi, localizarea genelor în cromozomi și gene cu funcții înrudite (de exemplu, la om și pui) sunt identificat. Sondele ADN sunt, de asemenea, utilizate în diagnosticare diverse boli.

Tehnologia ADN-ului recombinant a făcut posibilă o abordare proteică-genă neconvențională numită genetică inversă. Cu această abordare, o proteină este izolată din celulă, gena acestei proteine ​​este donată și este modificată, creând o genă mutantă care codifică o formă modificată a proteinei. Gena rezultată este introdusă în celulă. În acest fel, genele defecte pot fi corectate și pot fi tratate bolile ereditare.

Dacă ADN-ul hibrid este inserat într-un ou fertilizat, pot fi produse organisme transgenice care transmit gena mutantă descendenților.

Transformarea genetică a animalelor face posibilă stabilirea rolului genelor individuale și al produselor lor proteice atât în ​​reglarea activității altor gene, cât și în diferite procese patologice.

Tehnologia ADN recombinant folosește următoarele metode:

· Clivarea specifică a ADN-ului prin nucleaze de restricție, care accelerează izolarea și manipularea genelor individuale;

· Secvențierea rapidă a tuturor nucleotidelor fragmentului de ADN purificat, care vă permite să determinați limitele genei și secvența de aminoacizi codificată de aceasta;

· Construcția ADN-ului recombinant;

· Hibridarea acizilor nucleici, permițând identificarea unor secvențe specifice de ARN sau ADN cu o mai mare acuratețe și sensibilitate;

· Clonarea ADN: amplificare in vitro folosind o reacție în lanț a polimerazei sau introducerea unui fragment de ADN într-o celulă bacteriană, care, după o astfel de transformare, reproduce acest fragment în milioane de copii;

· Introducerea ADN recombinant în celule sau organisme.


2.

2.1. Izolarea genelor care conțin informatie necesara.

Producerea genelor este posibilă în mai multe moduri: izolarea de ADN, sinteza chimico-enzimatică și sinteza enzimatică.

Izolarea genelor din ADN se realizează folosind enzime de restricție care catalizează clivajul ADN-ului la locuri cu secvențe de nucleotide specifice (4-7 perechi de nucleotide). Clivarea poate fi efectuată în mijlocul regiunii recunoscute a perechilor de nucleotide; în acest caz, ambele catene de ADN sunt „tăiate” la același nivel. Fragmentele de ADN rezultate au așa-numitele capete „tocite”. Clivarea ADN-ului cu o schimbare este posibilă, cu una dintre catene proeminente pentru mai multe nucleotide. Capetele „lipioase” rezultate, datorită complementarității lor, interacționează. Secvența de nucleotide cu capete lipicioase poate fi atașată la un vector (pre-tratat cu aceeași enzimă de restricție), transformată într-una circulară ca rezultat al ligării ligazei capetelor reciproc complementare. Metoda are dezavantaje semnificative, deoarece este destul de dificil să se selecteze acțiunea enzimelor pentru a izola strict gena dorită. Alături de genă, sunt captate nucleotidele „extra” sau, dimpotrivă, enzimele taie o parte din genă, transformând-o într-una defectă funcțional.

Sinteza chimico-enzimatică este utilizată dacă se cunoaște structura primară a proteinei sau peptidei, a cărei sinteză codifică gena. Este necesară cunoașterea completă a secvenței de nucleotide a genei. Această metodă vă permite să recreați cu exactitate secvența de nucleotide dorită, precum și să introduceți în gene locuri de recunoaștere pentru endonucleaze de restricție, secvențe reglatoare etc. Metoda constă în sinteza chimică a fragmentelor de ADN monocatenar (oligonucleotide) prin pasul- formarea treptată a legăturilor eterice între nucleotide, de obicei 8-16... În prezent, există „mașini genetice” care, sub controlul unui microprocesor, sintetizează foarte rapid secvențe scurte specifice de ADN monocatenar.

Secvența de bază dorită este introdusă pe tastatură. Microprocesorul deschide supapele, prin care, cu ajutorul unei pompe, nukeotidele, precum și reactivii și solvenții necesari, sunt introduse secvenţial în coloana de sinteză. Coloana este umplută cu bile de siliciu pe care sunt asamblate molecule de ADN. Acest dispozitiv poate sintetiza lanțuri de până la 40 de nucleotide în lungime cu o rată de 1 nucleotidă în 30 de minute. Oligonucleotidele rezultate sunt cusute împreună folosind ADN ligază pentru a forma o nucleotidă dublu catenară. Această metodă a fost folosită pentru a obține gene pentru lanțurile A și B ale insulinei, proinsulinei, somatostatinei etc.

Sinteza genelor enzimatice bazată pe ARN mesager izolat (ARNm) este în prezent cea mai comună metodă. În primul rând, ARN-urile mesager sunt izolate din celule, printre care există ARNm codificat de gena care urmează să fie izolată. Apoi, în condiții aprobate, o catenă de ADN complementară ARNm (ADNc) este sintetizată pe ARNm izolat din celulă, ca pe un șablon, folosind transcriptază inversă (transcriptază inversă). ADN-ul complementar rezultat (ADNc) servește ca matriță pentru sinteza unei a doua catene de ADN folosind ADN polimerază sau revers transcriptază. Primerul este o oligonucleotidă complementară capătului 3' al ARNm; se formează o nouă catenă de ADN din trifosfați deoxinucleozidici în prezența ionilor de magneziu.

Metoda cu mare succes folosit pentru a obține în 1979 gena hormonului uman de creștere (somatotropina). Gena obținută într-un fel sau altul conține informații despre structura proteinei, dar nu o poate implementa singură. Prin urmare, sunt necesare mecanisme suplimentare pentru a controla acțiunea genei. Transferul informațiilor genetice în celula destinatarului se realizează ca parte a vectorului. Un vector este, de regulă, o moleculă circulară de ADN capabilă de auto-replicare. Gena, împreună cu vectorul, formează ADN recombinant.

2.2. Selectarea vectorilor (virusuri, plasmide) capabili de replicare independentă în celula primitoare.

Termenul "vector" se referă la o moleculă de acid nucleic capabilă de existență autonomă după ce a fost introdusă într-o celulă datorită prezenței semnalelor de replicare și transcripție în aceasta.

Moleculele vectoriale trebuie să aibă următoarele proprietăți:

1) capacitatea de a se replica în mod autonom în celula primitoare, adică de a fi un replicon independent;

În funcție de scopurile experimentului, vectorii pot fi împărțiți condiționat în două grupe: 1) utilizați pentru clonarea și amplificarea genei dorite; 2) specializat, folosit pentru exprimarea genelor străine inserate. Al doilea grup de vectori combină vectori proiectați pentru a asigura sinteza produselor proteice ai genelor clonate. Vectorii de expresie conțin secvențe de ADN care sunt necesare pentru transcrierea copiilor clonate de gene și pentru traducerea ARNm-ului lor în tulpini celulare.

Plasmidele, bacteriofagii sunt utilizați ca vectori procarioți; virusuri de animale și plante, vectori bazați pe drojdie de 2 μm și mitocondrii și o serie de vectori construiți artificial capabili să se replice atât în ​​celule bacteriene, cât și în celule eucariote (vectori navetă) sunt utilizați ca vectori eucarioți.

Plasmidele sunt elemente genetice extracromozomiale ale pro- și eucariote care se reproduc autonom în celule. Majoritatea vectorilor plasmidici au fost derivați din plasmidele naturale ColE1, pMB1 și p15A.

Plasmidele bacteriene sunt împărțite în două clase. Unele plasmide (de exemplu, factorul F bine studiat, care determină sexul în E. coli) sunt ele însele capabile să treacă de la celulă la celulă, în timp ce altele nu. Din mai multe motive și în primul rând pentru a preveni răspândirea necontrolată a materialului genetic potențial periculos, majoritatea covârșitoare a vectorilor plasmidii bacterieni se bazează pe plasmide de clasa II. Multe plasmide naturale conțin deja gene care determină rezistența celulelor la antibiotice (produșii acestor gene sunt enzime care modifică sau descompun substanțele antibiotice). În plus, în timpul construcției vectorilor, în aceste plasmide sunt introduse gene suplimentare care determină rezistența la alte antibiotice.

În fig. 1 prezintă unul dintre cei mai comuni vectori plasmidii E. coli - pBR322. Este construit pe baza plasmidei bine studiate E. coli - factorul colicinogen ColE1 - și conține originea replicării acestei plasmide. O caracteristică a plasmidei ColE1 (și, respectiv, pBR322) este că, în prezența unui inhibitor al sintezei proteinelor, antibioticul cloramfenicol (care inhibă indirect replicarea cromozomului gazdă), numărul său în E. coli crește de la 20-50. până la 1000 de molecule per celulă, ceea ce face posibilă obținerea unor cantități mari de genă donată. La construirea vectorului pBR322 din plasmidele originale, au fost delegate un număr de situsuri „extra” pentru endonucleaze de restricție.

În prezent, împreună cu multe sisteme de vectori convenabile pentru E. coli, vectorii plasmidii au fost proiectați pentru o serie de alte bacterii gram-negative (inclusiv cele importante din punct de vedere industrial precum Pseudomonas, Rhizobium și Azotobacter), bacterii gram-pozitive (Bacillus), ciuperci inferioare (drojdie) și plante....

Vectorii plasmidii sunt convenabil pentru donarea de fragmente relativ mici (până la 10 kb) ale genomilor mici. Dacă este necesară obținerea unei biblioteci de clone (sau biblioteci) de gene ale plantelor și animalelor superioare, a cărei lungime totală a genomului atinge dimensiuni enorme, atunci vectorii plasmidici obișnuiți sunt nepotriviți pentru aceste scopuri. Problema creării de biblioteci de gene pentru eucariotele superioare a fost rezolvată folosind derivați de bacteriofagi l ca vectori de clonare.

Dintre vectorii fagi, cele mai convenabile sisteme au fost create pe baza genomurilor bacteriofagelor E. coli l și M13. ADN-ul acestor fagi conține regiuni extinse care pot fi delegate sau înlocuite cu ADN străin fără a afecta capacitatea lor de a se replica în celulele E. coli. La construirea unei familii de vectori bazate pe ADN-ul fag, la început (prin diviziunea unor secțiuni scurte de ADN) multe site-uri de restricție au fost îndepărtate din regiunea neesențială pentru replicarea ADN-ului, iar astfel de situsuri au fost lăsate în regiunea destinată inserției de străini. ADN. Genele marker sunt adesea inserate în această regiune pentru a distinge ADN-ul recombinat de vectorul original. Astfel de vectori sunt folosiți pe scară largă pentru a genera „biblioteci de gene”. Dimensiunile fragmentului de ADN fag care urmează să fie înlocuit și, în consecință, secțiunea inserată de ADN străin, sunt limitate la 15-17 mii de resturi de nucleotide, deoarece genomul fagului recombinant, care este cu 10% mai mare sau cu 75% mai mic decât cel sălbatic. genomul fagilor, nu mai poate fi împachetat în particule de fagi.

Figura 1. Harta de restricție detaliată a plasmidei pBR322.

Teoretic, astfel de limitări nu există pentru vectorii construiți pe baza bacteriofagului filamentos M13. Sunt descrise cazuri când un ADN străin cu o lungime de aproximativ 40 de mii de resturi de nucleotide a fost introdus în genomul acestui fag. Se știe, totuși, că fagul M13 devine instabil atunci când lungimea ADN-ului străin depășește 5 mii de resturi de nucleotide. De fapt, vectorii obținuți din ADN-ul fagului M13 sunt utilizați în principal pentru secvențierea și mutageneza genelor, iar dimensiunile fragmentelor inserate în ele sunt mult mai mici.

Acești vectori sunt construiți din forma replicativă (dublu catenară) a ADN-ului fagului M13, în care sunt inserate regiuni „polilinker” (un exemplu de astfel de construcție este prezentat în Fig. 5). Într-o particulă de fag, ADN-ul este inclus sub forma unei molecule monocatenar. Astfel, acest vector face posibilă obținerea unei gene donate sau a unui fragment al acesteia atât în ​​forme dublu-catenar, cât și în forme monocatenare. Formele monocatenar de ADN recombinat sunt utilizate pe scară largă în prezent în determinarea secvenței de nucleotide a ADN-ului prin metoda Sanger și pentru mutageneza genei direcționate pe oligodeoxinucleotide.

Transferul genelor străine în celulele animale se realizează folosind vectori obținuți din ADN-ul unui număr de virusuri animale bine studiate - SV40, unele adenovirusuri, virusul papiloma bovin, virusul variolei și așa mai departe. Construcția acestor vectori se realizează conform schemei standard: îndepărtarea situsurilor „extra” pentru endonucleaze de restricție, introducerea de gene marker în regiunea ADN care nu sunt esențiale pentru replicarea acestuia (de exemplu, timidin kinaza (tk) gena de la HSV (virusul herpesului)), introducerea de regiuni reglatoare, creșterea nivelului de expresie a genelor.

Așa-numiții „vectori navetă”, care sunt capabili să se replice atât în ​​celulele animale, cât și în celulele bacteriene, s-au dovedit a fi convenabil. Ele sunt făcute prin legarea împreună a segmentelor mari de vectori animale și bacterieni (de exemplu SV40 și pBR322), astfel încât regiunile responsabile pentru replicarea ADN-ului să nu fie afectate. Acest lucru face posibilă efectuarea operațiunilor de bază de construire a unui vector într-o celulă bacteriană (care este mult mai simplă din punct de vedere tehnic) și apoi utilizarea ADN-ului recombinant rezultat pentru donarea genelor într-o celulă animală.

Figura 2. Harta de restricții a vectorului M13 mp8.

2.3. Prepararea ADN recombinant.

Esența construcției ADN recombinant este încorporarea fragmentelor de ADN, printre care există un segment de ADN de interes pentru noi, în așa-numitele molecule de ADN vector (sau pur și simplu vectori) - ADN plasmid sau viral care poate fi transferat în pro - sau celule eucariote și acolo se reproduc autonom citat. În etapa următoare, selectarea acelor celule care poartă ADN recombinat (folosind caracteristicile markerului pe care le posedă vectorul însuși), și apoi clonele individuale cu segmentul de ADN care ne interesează (folosind caracteristici sau sonde specifice pentru o anumită genă sau ADN). regiune) se realizează.

Atunci când se rezolvă o serie de probleme științifice și biotehnologice, construcția ADN-ului recombinant necesită și crearea unor sisteme în care să fie asigurată expresia maximă a genei clonate.

Există trei modalități principale de a încorpora ADN-ul străin în moleculele vectorului. În primul caz, cele 3 "capete ale fragmentelor de ADN, printre care există o regiune ADN de interes (o genă sau segmentul acesteia, o regiune reglatoare), sunt extinse cu o secvență de homopolinucleotide (de exemplu, poli (T)) cu cu ajutorul enzimei nucleotidil transferazei terminale.ADN-ul vector în același mod este crescut cu o secvență homopolinucleotidă complementară (adică poli (A)). Acest lucru permite ca două molecule de ADN să fie conectate prin împerechere complementară a capetelor „lipicioase” obținute artificial.

În al doilea caz, capete „lipicioase” sunt create prin scindarea moleculelor de ADN (atât vector, cât și care conțin fragmentul de interes pentru noi) cu una dintre endonucleazele de restricție (enzime de restricție). Enzimele de restricție se caracterizează printr-o specificitate extrem de ridicată. Ei „recunoaște” în ADN o secvență de mai multe resturi de nucleotide și scindează în ele legături internucleotide strict definite. Prin urmare, chiar și în ADN-ul de dimensiuni mari, enzimele de restricție introduc un număr limitat de pauze.

A treia metodă este o combinație a primelor două, când capetele lipicioase ale ADN-ului format de endonucleaza de restricție sunt extinse prin secvențe sintetice (Fig. 3).

Capetele fragmentelor de ADN pot fi transformate în unele „lipicioase” prin extinderea lor cu oligonucleotide dublu catenare („linkeri”), care includ un situs de recunoaștere de restricție.

Figura 3. Schema pentru construirea ADN-ului recombinant folosind enzimele de restricție PstI și poli (G) - poli (C) -linker.

zoey. Tratarea unui astfel de fragment cu această enzimă de restricție îl face potrivit pentru inserarea într-o moleculă de ADN vector digerată cu aceeași enzimă de restricție. Adesea, fragmentele de polinucleotide sunt folosite ca „linkeri” care conțin regiuni specifice pentru mai multe enzime de restricție simultan (se numesc „polilinkeri”).

După introducerea ADN-ului străin în vector, legarea lor covalentă este efectuată de ADN ligază. Dacă dimensiunea golului din molecula recombinată depășește o legătură fosfodiester, aceasta este construită in vitro folosind ADN polimeraza sau in vivo folosind sisteme de reparare celulară.

2.4. Introducerea ADN-ului recombinant într-o celulă - receptor

Transferul de ADN recombinant se realizează prin transformare sau conjugare. Transformarea este procesul de modificare a proprietăților genetice ale unei celule ca urmare a pătrunderii ADN-ului străin în ea. Pentru prima dată a fost descoperit în pneumococi de către F. Giffit, care a arătat că unele celule din tulpini nevirulente de bacterii, atunci când sunt infectate cu acestea la șoareci, împreună cu tulpini virulente, capătă proprietăți patogene. Ulterior, transformarea a fost demonstrată și studiată în diferite tipuri de bacterii. S-a stabilit că doar câteva, așa-numitele celule „competente” (capabile să includă ADN străin și să sintetizeze o proteină transformatoare specială) sunt capabile de transformare. Competența celulei este determinată și de factorii de mediu. Acest lucru poate fi facilitat prin tratarea celulelor cu polietilen glicol sau clorură de calciu. După pătrunderea în celulă, una dintre catenele ADN-ului recombiant se degradează, în timp ce cealaltă, datorită recombinării cu regiunea omoloagă a ADN-ului receptor, poate fi încorporată în unitatea cromozomală sau extracromozomală. Transformarea este cea mai versatilă modalitate de a transfera informații genetice și este de cea mai mare importanță pentru tehnologiile genetice.

Conjugarea este una dintre metodele de schimb de material genetic, în care are loc un transfer unidirecțional de informații genetice de la donator la primitor. Acest transfer este sub controlul unor plasmide conjugative specifice (factor de fertilitate). Transferul de informații de la celula donatoare la destinatar se realizează prin vilozități genitale speciale (pili). Transmiterea informațiilor este posibilă și cu ajutorul plasmidelor neconjugative cu participarea plasmidelor helper Transferul întregului set de gene virale sau fagice, care duce la dezvoltarea particulelor de fagi în celulă, se numește transfecție. Tehnica aplicată celulelor bacteriene include producerea de sferoplaste, purificarea mediului de incubare din nucleaze și adăugarea de ADN fag purificat (prezența sulfatului de protamină crește eficiența transfecției). Tehnica este aplicabilă celulelor animale și vegetale cu participarea vectorilor speciali de transfer virale.

3.

Când este aplicată la oameni, ingineria genetică ar putea fi folosită pentru a trata bolile ereditare. Cu toate acestea, din punct de vedere tehnic, există o diferență semnificativă între tratarea pacientului însuși și modificarea genomului descendenților săi.

Sarcina de a schimba genomul unui adult este oarecum mai dificilă decât reproducerea de noi rase de animale modificate genetic, deoarece în acest caz este necesară modificarea genomului a numeroase celule ale unui organism deja format și nu doar a unui embrion de ou. Pentru aceasta, se propune utilizarea particulelor virale ca vector. Particulele virale sunt capabile să pătrundă într-un procent semnificativ de celule adulte, încorporând informațiile lor ereditare în ele; posibilă multiplicare controlată a particulelor virale în organism. În același timp, pentru a reduce efectele secundare, oamenii de știință încearcă să evite introducerea ADN-ului modificat genetic în celulele organelor genitale, evitând astfel expunerea la viitorii descendenți ai pacientului. De asemenea, merită remarcată critica semnificativă la adresa acestei tehnologii în mass-media: dezvoltarea virușilor modificați genetic este percepută de mulți ca o amenințare pentru întreaga omenire.

Cu ajutorul terapiei genice, este posibil să se schimbe genomul uman în viitor. În prezent metode eficiente modificări în genomul uman sunt în curs de dezvoltare și testare la primate. Multă vreme, ingineria genetică a maimuțelor s-a confruntat cu dificultăți serioase, dar în 2009 experimentele au fost încununate de succes: revista Nature a publicat o publicație despre utilizarea cu succes a vectorilor virali modificați genetic pentru a vindeca un mascul adult de daltonism. În același an, prima primată modificată genetic (crescut dintr-un ou modificat), marmosetul comun, a dat naștere urmașilor.

Deși la scară mică, ingineria genetică este deja folosită pentru a oferi femeilor cu anumite tipuri de infertilitate șansa de a rămâne însărcinate. Pentru aceasta sunt folosite ouă de la femei sănătoase. Ca urmare, copilul moștenește genotipul de la un tată și două mame.

Cu toate acestea, posibilitatea de a face schimbări mai semnificative în genomul uman se confruntă cu o serie de probleme etice grave.

Concluzie

Ca urmare a dezvoltării intensive a metodelor de inginerie genetică, clonele multor gene de ARN ribozomal, transport și 5S, histone, globine de șoarece, iepure, umane, colagen, ovoalbumină, insulină umană și alți hormoni peptidici, interferon uman etc. au fost obținute.

Acest lucru a făcut posibilă crearea unor tulpini de bacterii care produc multe substanțe biologic active utilizate în medicină, agriculturăși industria microbiologică.

Pe baza ingineriei genetice, a apărut o ramură a industriei farmaceutice numită „industria ADN”. Aceasta este una dintre ramurile moderne ale biotehnologiei.

Insulina umană (humulina) obținută prin intermediul recDNA este permisă pentru uz terapeutic. În plus, pe baza a numeroși mutanți pentru gene individuale obținute în timpul studiului lor, au fost create sisteme de testare extrem de eficiente pentru a identifica activitatea genetică a factorilor de mediu, inclusiv pentru detectarea compușilor cancerigeni.


REFERINȚE:

1) Bekish O.-Ya.L. Biologie medicală. - Minsk: Urajay, 2000 .-- p. 114-119.

2) Mutovin G.R. Fundamentele geneticii clinice. - M .: Şcoala superioară, 1997. - p. 83-84.

3) Hare R.S. Fundamentele Geneticii Medicale. - Minsk: Școala superioară, 1998. - p. 60-65.

4) biotechnolog.ru

Plan:

Introducere.

1. Esența ingineriei genetice.

1.1. Istoria ingineriei genetice

1.2. Concept de inginerie genetică

1.3. Scopurile și obiectivele ingineriei genetice

2. Etapele creării organismelor cu un program modificat genetic.

2.1. Izolarea genelor (naturale sau sintetizate) care conțin informațiile necesare.

2.2. Selectarea vectorilor (virusuri, plasmide) capabili de replicare independentă în celula primitoare.

2.3. Prepararea ADN recombinant.

2.4. Introducerea ADN-ului recombinant într-o celulă primitoare.

3.Aplicarea tehnologiilor de inginerie genetică în medicină.

Ingineria genetică și biotehnologia modernă au apărut ca urmare a dezvoltării microbiologiei, geneticii și biochimiei. Realizările în biologia moleculară, genetica moleculară, biologia celulară, precum și metodele experimentale recent descoperite și echipamentele noi au oferit un ritm incredibil de dezvoltare a ingineriei genetice și a biotehnologiei.

Scopul ingineriei genetice

Scopul ingineriei genetice este de a schimba structura genelor, locația lor pe cromozom și de a le regla activitatea în conformitate cu nevoile umane. Pentru a atinge acest obiectiv, aplicați metode diferite permițând producerea de proteine ​​la scară industrială, creând noi soiuri de plante și rase de animale care îndeplinesc cel mai bine cerințele, diagnosticând și tratând diferite boli infecțioase și ereditare umane.

Obiectele cercetării în inginerie genetică sunt virușii, bacteriile, ciupercile, animalele (inclusiv corpul uman) și celulele vegetale. După purificarea moleculei de ADN a acestor ființe vii din alte substanțe ale celulei, diferențele materiale dintre ele dispar. Molecula de ADN purificată poate fi scindată cu ajutorul enzimelor în bucăți specifice, care apoi, dacă este necesar, pot fi legate împreună cu ajutorul enzimelor de reticulare. Metode moderne ingineria genetică vă permite să înmulțiți orice bucată de ADN sau să înlocuiți orice nucleotidă dintr-un lanț de ADN cu alta. Desigur, aceste succese au fost obținute ca urmare a unui studiu consecvent al legilor eredității.

Ingineria genetică (ingineria genetică) a apărut ca urmare a descoperirii enzimelor care împart într-un mod specific baza materială a eredității - molecula de ADN în segmente și conectează aceste segmente cu capetele lor între ele, precum și metoda electroforetică, ceea ce face posibilă separarea segmentelor de ADN de-a lungul lungimii cu mare precizie. Crearea de metode și echipamente pentru determinarea secvenței specifice de nucleotide care formează o moleculă de ADN, precum și pentru sinteza automată a oricărei bucăți de ADN dorite, a asigurat dezvoltarea ingineriei genetice într-un ritm rapid.

Dezvoltarea în rândul oamenilor de știință a dorinței de a controla ereditatea a fost facilitată de dovezi că baza eredității tuturor plantelor și animalelor este molecula de ADN, că bacteriile și fagii respectă, de asemenea, legile eredității, că procesul mutațional este comun tuturor ființelor vii. și poate fi reglat prin metode experimentale.

Louis Pas-ter

Marele om de știință francez Louis Pas-ter, după ce a dezvoltat o metodă de obținere a clonelor, a fost primul care a arătat că bacteriile sunt diverse, posedă o moștenire și proprietățile lor sunt strâns legate de acestea din urmă (Fig. 1, 2).

Tworth și D'Arrell

În 1915, Twort și D'Errel au demonstrat că fagii (fagii sunt viruși care se înmulțesc în bacterii), înmulțindu-se spontan în interiorul bacteriilor, îi pot distruge. Microbiologii și-au pus speranțele în utilizarea fagilor împotriva microbilor - agenți cauzatori ai periculoșilor boli infecțioase... Cu toate acestea, bacteriile sunt rezistente la fagi din cauza mutațiilor spontane auto-arbitrare. Moștenirea acestor mutații împiedică bacteriile să fie distruse de fagi.

Reproducându-se în interiorul unei celule, virușii și fagii o pot distruge sau, după ce au pătruns în genomul celulei, pot modifica ereditatea acesteia. Pentru a schimba ereditatea unui organism, procesele de transformare și transducție sunt utilizate pe scară largă.

Joshua și Esther Lederberg

În 1952, Joshua și Esther Lederberg, folosind metoda copierii (replicarii) coloniilor bacteriene, au dovedit existența mutațiilor spontane la bacterii (Fig. 3). Ei au dezvoltat o metodă de a izola celulele mutante folosind replicarea. Sub influența mediului extern, frecvența mutațiilor crește. Metode speciale vă permit să vedeți cu ochiul liber clonele de tulpini noi formate ca urmare a mutațiilor.

Metoda de replicare colonii bacteriene se realizează după cum urmează. Pânza de catifea sterilizată este trasă pe suprafața unui dispozitiv din lemn și atașată de o colonie de bacterii care crește pe suprafața unei cutii Petri destinate transplantului de replici. Apoi coloniile sunt transferate într-un vas Petri curat cu un mediu nutritiv artificial. Material de pe site

Etape de inginerie genetică

Ingineria genetică se realizează în mai multe etape.

  • Gena de interes este determinată de funcțiile sale, apoi este izolată, clonată și se studiază structura ei.
  • Gena izolată este combinată (recombinată) cu ADN-ul unui fag, transpozon sau plasmidă care are capacitatea de a se recombina cu cromozomul și în acest fel se creează un construct de vector.
  • Construcția vectorială este inserată într-o celulă (transformare) și se obține o celulă transgenică.
  • Organismele mature pot fi obținute dintr-o celulă transgenică în condiții artificiale.
11 iulie 2008

Inginerie genetică(ingineria genetică) - un set de metode și tehnologii, inclusiv tehnologii pentru producerea acizilor ribonucleici și dezoxiribonucleici recombinanți, pentru izolarea genelor din organism, manipularea genelor și introducerea acestora în alte organisme.

Ingineria genetică este o parte integrantă a biotehnologiei moderne, baza sa teoretică este biologia moleculară și genetica. Esența noii tehnologii este direcționată, conform unui program prestabilit, construcția sistemelor genetice moleculare în afara corpului (in vitro) cu introducerea ulterioară a structurilor create într-un organism viu. Ca urmare, se realizează includerea și activitatea lor într-un organism dat și în descendenții acestuia. Posibilitățile ingineriei genetice - transformarea genetică, transferul de gene străine și alți purtători materiale ai eredității în celulele plantelor, animalelor și microorganismelor, producerea de organisme modificate genetic (modificate genetic, transgenice) cu noi unice genetice, biochimice și fiziologice proprietăți și caracteristici, a face această direcție este strategică.

Din punct de vedere al metodologiei, ingineria genetică îmbină principiile fundamentale (genetica, teoria celulară, biologia moleculară, biologia sistemelor), realizările celor mai moderne științe post-genomice: genomica, metabolomica, proteomica cu realizări reale în domenii aplicate: biomedicină. , agrobiotehnologie, bioenergie, biofarmacologie, bioindustrie etc.

Ingineria genetică aparține (împreună cu biotehnologia, genetica, biologia moleculară și o serie de alte științe ale vieții) științelor naturale.

Referință istorică

Ingineria genetică a apărut datorită muncii multor cercetători din diverse ramuri ale biochimiei și geneticii moleculare. În 1953, J. Watson și F. Crick au creat un model dublu catenar de ADN, la începutul anilor 50 - 60 ai secolului XX, proprietățile codului genetic au fost clarificate, iar la sfârșitul anilor 60 universalitatea acestuia a fost confirmată experimental. A existat o dezvoltare intensivă a geneticii moleculare, ale cărei obiecte erau E. coli, virusurile și plasmidele sale. Au fost dezvoltate metode pentru izolarea preparatelor înalt purificate de molecule de ADN intacte, plasmide și virusuri. ADN-ul virusurilor și plasmidelor a fost introdus în celule într-o formă biologic activă, asigurând replicarea acestuia și exprimarea genelor corespunzătoare. În 1970, H. Smith a fost primul care a izolat o serie de enzime - enzime de restricție, potrivite pentru scopuri de inginerie genetică. G. Smith a descoperit că enzima HindII purificată obținută din bacterii păstrează capacitatea de a tăia moleculele de acid nucleic (activitatea nucleazei), care este caracteristică bacteriilor vii. Combinația de enzime de restricție ADN (pentru tăierea moleculelor de ADN în anumite fragmente) și enzime izolate încă din 1967 - ligazele ADN (pentru „cusătura” fragmentelor într-o secvență arbitrară) poate fi considerată pe bună dreptate veriga centrală în tehnologia ingineriei genetice.

Astfel, la începutul anilor '70, au fost formulate principiile de bază ale funcționării acizilor nucleici și proteinelor într-un organism viu și au fost create premisele teoretice pentru inginerie genetică.

Academicianul A.A. Baev a fost primul om de știință din țara noastră care a crezut în promisiunea ingineriei genetice și a condus cercetări în acest domeniu. Ingineria genetică (prin definiția sa) este construcția in vitro a structurilor genetice active funcțional (ADN recombinant), sau cu alte cuvinte, crearea de programe genetice artificiale.

Sarcini și metode de inginerie genetică

Este bine cunoscut faptul că reproducerea tradițională are o serie de limitări care împiedică dezvoltarea de noi rase de animale, soiuri de plante sau rase de microorganisme practic valoroase:

1. lipsa recombinării la speciile neînrudite. Există bariere puternice între specii care împiedică recombinarea naturală.
2. incapacitatea de a controla din exterior procesul de recombinare din organism. Lipsa omologiei dintre cromozomi duce la incapacitatea de a converge și a face schimb de regiuni (și gene) individuale în timpul formării celulelor germinale. Ca urmare, devine imposibilă transferarea genelor necesare și asigurarea combinației optime în noul organism a genelor obținute din diferite forme parentale;
3. incapacitatea de a seta cu precizie trăsăturile și proprietățile urmașilor, deoarece procesul de recombinare este statistic.

Mecanismele naturale care păzesc puritatea și stabilitatea genomului organismului sunt aproape imposibil de depășit prin metodele selecției clasice.

Tehnologia de producere a organismelor modificate genetic (OMG) rezolvă în mod fundamental problemele depășirii tuturor barierelor naturale și interspecifice de recombinare și reproducere. Spre deosebire de reproducerea tradițională, în timpul căreia genotipul suferă modificări doar indirect, ingineria genetică vă permite să interveniți direct în aparatul genetic folosind tehnica clonării moleculare. Ingineria genetică vă permite să operați cu orice gene, chiar și sintetizate artificial sau aparținând unor organisme neînrudite, să le transferați de la o specie la alta și să le combinați în orice ordine.

Tehnologia include mai multe etape de creare a OMG-urilor:

1. Obținerea unei gene izolate.
2. Introducerea unei gene într-un vector pentru inserarea într-un organism.
3. Transferul vectorului cu constructul în organismul receptor modificat.
4. Clonarea moleculară.
5. Selectarea OMG-urilor.

Prima etapă - sinteza, izolarea și identificarea fragmentelor țintă de ADN sau ARN și elemente de reglementare este foarte bine concepută și automatizată. O genă izolată poate fi, de asemenea, obținută dintr-o bibliotecă de fagi.

A doua etapă este crearea in vitro (in vitro) a unui construct genetic (transgenă), care conține unul sau mai multe fragmente de ADN (codifică secvența de aminoacizi a proteinelor) în combinație cu elemente de reglare (acestea din urmă asigură activitatea transgenelor în corpul). Apoi transgenele sunt introduse în ADN-ul vectorului de clonare folosind instrumente de inginerie genetică - enzime de restricție și ligaze. Pentru descoperirea enzimelor de restricție, Werner Arber, Daniel Nathans și Hamilton Smith au primit Premiul Nobel (1978). De regulă, plasmidele sunt folosite ca vectori - molecule circulare mici de ADN de origine bacteriană.

Următoarea etapă este de fapt „modificarea genetică” (transformarea), adică. transferul constructului „ADN încorporat vector” în celule vii individuale. Introducerea unei gene gata făcute în aparatul ereditar al celulelor vegetale și animale este o problemă complexă, care a fost rezolvată după studierea caracteristicilor introducerii ADN-ului străin (virus sau bacterii) în aparatul genetic al celulei. Procesul de transfecție a fost folosit ca principiu al introducerii materialului genetic în celulă.

Dacă transformarea are succes, atunci după replicarea efectivă dintr-o celulă transformată, apar multe celule fiice, care conțin un construct genetic creat artificial. Baza apariției unei noi trăsături într-un organism este biosinteza proteinelor noi pentru organism - produse transgene, de exemplu, plante - rezistența la secetă sau insecte dăunătoare la plantele modificate genetic.

Pentru organismele unicelulare, procesul de modificare genetică este limitat la inserarea unei plasmide recombinate, urmată de selecția descendenților modificați (clone). Pentru organismele multicelulare superioare, de exemplu, plante, este obligatoriu să se includă în ADN-ul cromozomilor sau al organelelor celulare (cloroplaste, mitocondrii), urmată de regenerarea întregii plante dintr-o celulă izolată separată pe medii nutritive. În cazul animalelor, celulele cu genotipul modificat sunt injectate în blastocidele mamei surogat. Primele plante modificate genetic au fost obținute în 1982 de oamenii de știință de la Institutul de Industrie a Plantelor din Köln și de la compania Monsanto.

Direcții principale

Era post-genomică din primul deceniu al secolului al XXI-lea a ridicat dezvoltarea ingineriei genetice la un nou nivel. Așa-numitul Protocol de la Köln „Către o bioeconomie bazată pe cunoaștere” a definit bioeconomia ca „transformarea cunoștințelor științelor vieții în produse noi, durabile, eficiente din punct de vedere ecologic și competitive”. Harta rutiera ingineria genetică cuprinde o serie de domenii: terapie genetică, bioindustria, tehnologii bazate pe celule stem animale, plante MG, animale MG etc.

Plante modificate genetic

Există diferite moduri de a introduce ADN străin în plante.

Pentru plantele dicotiledonate, există un vector natural pentru transferul orizontal al genelor: plasmidele Agrobacterium. În ceea ce privește monocotiledoneele, deși în ultimii ani s-au obținut anumite succese în transformarea lor cu vectori agrobacterieni, o astfel de cale de transformare întâmpină totuși dificultăți semnificative.

Pentru transformarea plantelor rezistente la Agrobacterium s-au dezvoltat metode de transfer fizic direct al ADN-ului în celulă, acestea includ: bombardarea cu microparticule sau metoda balistică; electroporare; prelucrare cu polietilen glicol; Transferul de ADN în lipozomi etc.

După efectuarea transformării țesutului vegetal într-un fel sau altul, acesta este plasat in vitro pe un mediu special cu fitohormoni, care favorizează proliferarea celulară. Mediul conține de obicei un agent selectiv împotriva căruia celulele transgenice, dar necontrol, devin rezistente. Regenerarea trece cel mai adesea prin stadiul calusului, după care, odată cu selectarea corectă a mediilor, începe organogeneza (formarea lăstarilor). Lăstarii formați sunt transferați în mediu de înrădăcinare, deseori conținând și un agent selectiv pentru o selecție mai strictă a indivizilor transgenici.

Primele plante transgenice (plante de tutun cu gene inserate de la microorganisme) au fost obținute în 1983. Primele teste de teren de succes cu plante transgenice (plante de tutun rezistente la infecția virală) au fost efectuate în SUA încă din 1986.

După trecerea tuturor testelor necesare pentru toxicitate, alergenitate, mutagenitate etc. primele produse transgenice au fost comercializate în SUA în 1994. Acestea au fost roșiile cu maturare întârziată Flavr Savr de la Calgen și soia rezistentă la erbicide de la Monsanto. În 1-2 ani, firmele biotehnologice pun pe piață o serie de plante modificate genetic: roșii, porumb, cartofi, tutun, soia, rapiță, dovlecel, ridichi și bumbac.

În Federația Rusă, posibilitatea de a obține cartofi transgenici prin metoda transformării bacteriene folosind Agrobacterium tumefaciens a fost demonstrată în 1990.

În prezent, sute de firme comerciale din întreaga lume sunt angajate în producția și testarea plantelor modificate genetic, cu un capital combinat de peste 100 de miliarde de dolari. Biotehnologia plantelor modificate genetic a devenit deja o ramură importantă a producției de alimente și altele produse utile atragerea de resurse umane și fluxuri financiare semnificative.

În Rusia, sub conducerea academicianului K.G. Scriabin (Centrul de Bioinginerie, Academia Rusă de Științe) a obținut și caracterizat soiurile de cartofi modificate genetic Elizaveta plus și Lugovskoy plus rezistente la gândacul cartofului Colorado. Conform rezultatelor inspecției efectuate de către Serviciul Federal de Supraveghere a Protecției Drepturilor Consumatorului și a bunăstării umane, pe baza avizului experților Institutului de Cercetare de Stat al Nutriției din cadrul Academiei Ruse de Științe Medicale, aceste soiuri au trecut înregistrarea de stat, intrat în Registrul de statși sunt permise pentru import, fabricare și circulație pe teritoriul Federației Ruse.

Aceste soiuri de cartofi MG sunt fundamental diferite de cele obișnuite prin prezența unei gene încorporate în genomul său, care determină protecția 100% a culturilor împotriva gândacului de cartofi din Colorado, fără utilizarea de substanțe chimice.

Primul val de plante transgenice permise pentru utilizare practică conținea gene de rezistență suplimentare (la boli, erbicide, dăunători, deteriorare în timpul depozitării, stres).

Etapa actuală în dezvoltarea ingineriei genetice a plantelor se numește „ingineria metabolică”. În acest caz, sarcina nu este atât de a îmbunătăți anumite calități existente ale plantei, ca în ameliorarea tradițională, cât de a învăța planta să producă compuși complet noi folosiți în medicină, producția chimică și alte domenii. Acești compuși pot fi, de exemplu, acizi grași speciali, proteine ​​utile cu conținut ridicat de aminoacizi esențiali, polizaharide modificate, vaccinuri comestibile, anticorpi, interferoni și alte proteine ​​„medicinale”, polimeri noi care nu se înfundă. mediu inconjurator si multi multi altii. Utilizarea plantelor transgenice face posibilă stabilirea unei producții la scară largă și ieftină a unor astfel de substanțe și, prin urmare, le face mai accesibile pentru consumul pe scară largă.

Animale modificate genetic

Celulele animale diferă semnificativ de celulele bacteriene prin capacitatea lor de a absorbi ADN străin; prin urmare, metodele și metodele de introducere a genelor în celulele embrionare ale mamiferelor, muștelor și peștilor rămân în centrul atenției inginerilor genetici.

Cel mai studiat mamifer genetic sunt șoarecii. Primul succes datează din 1980, când D. Gordon și colegii săi au demonstrat posibilitatea introducerii și integrării ADN-ului străin în genomul șoarecilor. Integrarea a fost stabilă și a persistat la descendenți. Transformarea se realizează prin microinjectare a genelor clonate într-unul sau ambii pronuclei (nuclei) ai unui nou embrion în stadiul unei celule (zigot). Pronucleul masculin introdus de spermatozoizi este mai des ales, deoarece dimensiunea lui este mai mare. După injectare, ovulul este implantat imediat în oviductul mamei adoptive sau lăsat să se dezvolte în cultură până la stadiul de blastocist, după care este implantat în uter.

Astfel, au fost injectate genele pentru interferonul uman și insulină, gena β-globinei de iepure, gena timidin kinazei virusului herpes simplex și ADNc al virusului leucemiei de șoarece. Numărul de molecule injectate per injecție variază de la 100 la 300.000, iar dimensiunea lor variază de la 5 la 50 kb. De obicei, 10 - 30% dintre ouă supraviețuiesc, iar proporția de șoareci născuți din ouă transformate variază de la câteva până la 40%. Astfel, eficiența reală este de aproximativ 10%.

Această metodă a fost folosită pentru a obține șobolani modificați genetic, iepuri, oi, porci, capre, viței și alte mamifere. La noi s-au obținut porci purtători de gena somatotropinei. Nu diferă în ritmul de creștere față de animalele normale, dar modificarea metabolismului a afectat conținutul de grăsime. La astfel de animale, procesele de lipogeneză au fost inhibate și sinteza proteinelor a fost activată. Inserarea genelor pentru factorul asemănător insulinei a dus, de asemenea, la o schimbare a metabolismului. Porcii MG au fost creați pentru a studia lanțul de transformări biochimice ale hormonului, iar efectul secundar a fost de a întări sistemul imunitar.

Cel mai puternic sistem de sinteză a proteinelor se găsește în celulele glandei mamare. Dacă puneți genele proteinelor străine sub controlul unui promotor de cazeină, atunci expresia acestor gene va fi puternică și stabilă, iar proteina se va acumula în lapte. Cu ajutorul bioreactoarelor animale (vaci transgenice), s-a obținut deja lapte, care conține proteina umană lactoferină. Această proteină este planificată a fi utilizată pentru prevenirea bolilor gastroenterologice la persoanele cu imunorezistență scăzută: pacienți cu SIDA, prematuri, pacienți cu cancer care au suferit radioterapie.

Un domeniu important al transgenezei este producerea de animale rezistente la boli. Gena interferonului, care este o proteină protectoare, a fost introdusă în diferite animale. Șoarecii transgenici au câștigat rezistență - nu s-au îmbolnăvit sau s-au îmbolnăvit puțin, dar la porci acest efect nu a fost găsit.

Aplicație în cercetarea științifică

Gene knockout este o tehnică de îndepărtare a unuia sau Mai mult gene, care vă permite să explorați funcția genei. Pentru a obține șoareci knockout, constructul obținut prin inginerie genetică este introdus în celulele stem embrionare, unde constructul suferă recombinare somatică și înlocuiește gena normală, iar celulele modificate sunt implantate în blastocistele unei mame surogat. Plantele și microorganismele sunt eliminate într-un mod similar.

Expresia artificială este adăugarea unei gene în organism pe care nu o avea înainte, tot în scopul studierii funcției genelor. Vizualizarea produsului genetic - Folosit pentru a studia localizarea unui produs genetic. Înlocuirea unei gene normale cu o genă construită fuzionată cu un element raportor (de exemplu, cu o genă de proteină verde fluorescentă) oferă vizualizarea produsului de modificare a genei.

Investigarea mecanismului de expresie. O mică bucată de ADN situată în fața regiunii codificatoare (promotorul) și care servește la legarea factorilor de transcripție este introdusă în organism, după care, în locul propriei gene, un reporter, de exemplu, GFP, catalizează o reacție ușor de detectat. Pe lângă faptul că funcționarea promotorului în anumite țesuturi la un moment dat sau altul devine clar vizibilă, astfel de experimente fac posibilă studierea structurii promotorului prin îndepărtarea sau adăugarea de fragmente de ADN la acesta, precum și îmbunătățirea artificială. expresia genelor.

Biosecuritatea activităților de inginerie genetică

În 1975, oamenii de știință din întreaga lume la conferința Asilomar au ridicat cea mai importantă întrebare: va avea apariția OMG-urilor un impact potențial negativ asupra diversitate biologica? Din acel moment, concomitent cu dezvoltarea rapidă a ingineriei genetice, a început să se dezvolte o nouă direcție - biosecuritatea. Sarcina sa principală este de a evalua dacă utilizarea OMG-urilor are un efect nedorit asupra mediului, sănătății umane și animale, iar scopul său principal este de a deschide calea spre utilizarea realizărilor biotehnologiei moderne, garantând în același timp siguranța.

Strategia de biosecuritate se bazează pe cercetarea științifică privind caracteristicile OMG-urilor, experiența cu acestea, precum și informații despre utilizarea lor prevăzută și mediul în care vor fi introduse. Prin eforturi comune pe termen lung ale organizațiilor internaționale (UNEP, OMS, OCDE), experți din diferite țări, inclusiv Rusia, au fost dezvoltate concepte și proceduri de bază: siguranță biologică, pericol biologic, risc, evaluare a riscurilor. Numai după ce întregul ciclu de controale a fost efectuat cu succes, se elaborează un aviz științific privind siguranța biologică a OMG-urilor. În 2005, OMS a publicat un raport conform căruia plantele modificate genetic înregistrate în alimente sunt la fel de sigure ca și omologii lor tradiționali.

Cum este asigurată biosecuritatea în Rusia? Ratificarea „Convenției privind biodiversitatea” în 1995 poate fi considerată începutul includerii Rusiei în sistemul mondial de biosecuritate. Din acel moment, a început formarea sistemului național de biosecuritate, al cărui punct de plecare a fost intrarea în vigoare a Legii federale a Federației Ruse „Cu privire la reglementarea de stat în domeniul ingineriei genetice” (1996). Legea federală stabilește conceptele și principiile de bază ale reglementării de stat și controlului tuturor tipurilor de lucru cu OMG-uri. Legea federală stabilește niveluri de risc în funcție de tipul de OMG și de tipul de muncă, oferă definiții pentru sisteme deschise, eliberarea de OMG etc.

În ultimii ani, în Rusia a apărut unul dintre cele mai stricte sisteme de reglementare. Este neobișnuit ca sistemul de reglementare de stat a OMG-urilor a început preventiv, în 1996, înainte ca organisme reale modificate genetic să fie declarate pentru comercializare pe teritoriul Rusiei (primul OMG - soia MG - a fost înregistrat pentru uz alimentar în 1999). Instrumentele legale de bază sunt înregistrarea de stat a organismelor modificate genetic, precum și a produselor obținute din acestea sau care le conțin, destinate utilizării ca hrană și hrană pentru animale.

Pentru a înțelege situația actuală, este important ca, în cei 25 de ani care au trecut de la prima introducere a plantelor modificate genetic pe piață, să nu fi fost identificat niciun impact negativ de încredere asupra mediului și asupra sănătății umane și animale, nici în timpul testării, nici în timpul uz comercial. Doar una dintre sursele lumii - raportul societății autorizate AGBIOS „Essential Biosafety” conține peste 1000 de referințe la cercetări care demonstrează că alimentele și furajele obținute din culturi biotehnologice sunt la fel de sigure ca și produsele tradiționale. Cu toate acestea, astăzi în Rusia nu există un cadru de reglementare care să permită eliberarea în mediul înconjurător a plantelor modificate genetic de pe teritoriul țării noastre, precum și a produselor obținute din acestea sau care le conțin. Drept urmare, în 2010, nicio plantă modificată genetic nu este cultivată pe teritoriul Federației Ruse în scopuri comerciale.

Conform prognozei, conform Protocolului de la Köln (2007), până în 2030 atitudinea față de culturile agricole modificate genetic se va schimba față de aprobarea utilizării acestora.

Realizări și perspective de dezvoltare

Ingineria genetică în medicină

Nevoile de asistență medicală, nevoia de a rezolva problemele de îmbătrânire a populației formează o cerere constantă de produse farmaceutice modificate genetic (cu vânzări anuale de 26 miliarde USD) și produse medicale și cosmetice din materii prime vegetale și animale (cu vânzări anuale de aproximativ 40 miliarde dolari). SUA).

Dintre numeroasele progrese ale ingineriei genetice care au primit aplicații în medicină, cea mai semnificativă este producția de insulină umană la scară industrială.

În prezent, conform OMS, există aproximativ 110 milioane de oameni cu diabet în lume. Insulina, ale cărei injecții sunt indicate pentru pacienții cu această boală, au fost obținute de mult timp din organe animale și utilizate în practica medicală. Cu toate acestea, utilizarea pe termen lung a insulinei animale duce la deteriorarea ireversibilă a multor organe ale pacientului din cauza reacțiilor imunologice cauzate de injectarea de insulină animală străină corpului uman. Dar chiar și cerințele pentru insulină animală au fost îndeplinite până de curând cu doar 60 - 70%. Inginerii genetici au clonat gena insulinei ca prima lor sarcină practică. Genele insulinei umane clonate au fost introduse cu o plasmidă într-o celulă bacteriană, unde a început sinteza unui hormon, pe care tulpinile microbiene naturale nu l-au sintetizat niciodată. Din 1982, firme din SUA, Japonia, Marea Britanie și alte țări produc insulină modificată genetic. În Rusia, producția de insulină umană modificată genetic - Insuran se realizează la Institutul de Chimie Bioorganică. MM. Shemyakin și Yu.A. Ovchinnikov RAS. Astăzi, insulina domestică este produsă într-un volum suficient pentru a furniza pacienţilor cu diabet la Moscova. În același timp, cererea întregii piețe ruse de insulină modificată genetic este satisfăcută în principal de provizii de import. Piața mondială de insulină este în prezent de peste 400 de milioane de dolari, consumul anual este de aproximativ 2500 kg.

Dezvoltarea ingineriei genetice în anii 80 ai secolului trecut a oferit Rusiei un început bun în crearea tulpinilor modificate genetic de microorganisme cu proprietăți dorite - producători de substanțe biologic active, în dezvoltarea metodelor modificate genetic pentru reconstrucția materialului genetic al viruși, în obținerea de substanțe medicinale, inclusiv prin utilizarea simulării pe computer. Interferonul recombinant și formele de dozare bazate pe acesta în scopuri medicale și veterinare, interleukina (b-leukina), eritropoietina au fost aduse în stadiul de producție. În ciuda cererii în creștere pentru medicamente înalt purificate, producția internă de imunoglobuline, albumină, plasmol asigură 20% din nevoile pieței interne.

Se desfășoară în mod activ cercetări pentru a dezvolta vaccinuri pentru prevenirea și tratamentul hepatitei, SIDA și a unui număr de alte boli, precum și vaccinuri conjugate de nouă generație împotriva celor mai semnificative infecții din punct de vedere social. Vaccinurile cu subunități polimerice de o nouă generație constau din antigene de protecție înalt purificate de diferite naturi și un purtător - un polioxidonium imunostimulant, care oferă nivel ridicat răspuns imun specific. Rusia ar putea oferi vaccinări împotriva majorității covârșitoare a infecțiilor cunoscute pe baza propriei sale producții imunologice. Numai producția de vaccin împotriva rubeolei este complet absentă.

Inginerie genetică pentru agricultură

Îmbunătățirea genetică a culturilor și plantelor ornamentale este un proces lung și continuu care utilizează tehnologii din ce în ce mai precise și previzibile. Un raport științific al ONU din 1989 spune: „Deoarece tehnicile moleculare sunt cele mai precise, cei care le folosesc au mai multă încredere în trăsăturile pe care le transmit plantelor și, prin urmare, sunt mai puțin probabil să experimenteze efecte nedorite decât atunci când folosesc metode convenționale de ameliorare”.

Beneficiile noilor tehnologii sunt deja utilizate pe scară largă în țări precum Statele Unite, Argentina, India, China și Brazilia, unde culturile modificate genetic sunt cultivate pe suprafețe mari.

Noile tehnologii sunt, de asemenea, esențiale pentru fermierii săraci și pentru oamenii din țările sărace, în special pentru femei și copii. De exemplu, bumbacul și porumbul modificat genetic, rezistent la dăunători, necesită niveluri mult mai scăzute de insecticid (ceea ce face ca munca în fermă să fie mai sigură). Astfel de culturi contribuie la randamente mai mari, la venituri mai mari pentru fermieri, la reducerea sărăciei și la riscul de otrăvire a populației cu pesticide chimice, ceea ce este valabil mai ales în mai multe țări, inclusiv India, China, Africa de Sud și Filipine.

Cele mai comune culturi modificate genetic sunt cele care sunt rezistente la erbicidele ieftine, cele mai puțin toxice și cele mai utilizate pe scară largă. Cultivarea unor astfel de culturi vă permite să obțineți un randament mai mare la hectar, să scăpați de plivitul manual epuizant, să cheltuiți mai puțini bani din cauza lucrului minim sau fără prelucrare a solului, care, la rândul său, duce la o scădere a eroziunii solului.

În 2009, culturile modificate genetic din prima generație au fost înlocuite cu produse din a doua generație, ceea ce a dus pentru prima dată la o creștere a randamentelor per se. Un exemplu de nouă clasă de cultură biotehnologică (la care au lucrat mulți cercetători) este soia RReady2Yield™ tolerantă la glifosat, cultivată în 2009 în Statele Unite și Canada pe mai mult de 0,5 milioane de hectare.

Introducerea ingineriei genetice în agrobiologia modernă poate fi ilustrată prin următoarele fapte dintr-o serie de evaluări inter pares din străinătate, inclusiv sondajul anual al Serviciului internațional de monitorizare independent pentru aplicarea agrobiotehnologiei (ISAAA), condus de expertul de renume mondial Claiv James: (www.isaaa.org)

În 2009, 25 de țări ale lumii au cultivat culturi modificate genetic pe o suprafață de 134 de milioane de hectare (care reprezintă 9% din 1,5 miliarde de hectare din toate terenurile arabile din lume). Șase țări UE (din 27) au cultivat porumb Bt, iar în 2009 suprafața sa cultivată a ajuns la peste 94.750 de hectare. Analiza efectului economic global al utilizării culturilor biotehnologice pentru perioada 1996-2008. arată o creștere a profiturilor de 51,9 miliarde dolari din două surse: în primul rând, este vorba de o scădere a costurilor de producție (50%) și, în al doilea rând, de o creștere semnificativă a randamentului (50%) în valoare de 167 de milioane de tone.

În 2009, valoarea de piață globală a semințelor modificate genetic a fost de 10,5 miliarde de dolari. Valoarea totală a cerealelor biotehnologice de porumb și soia, precum și a bumbacului a fost în 2008 de 130 de miliarde de dolari și este de așteptat să crească cu 10-15% anual.

Se estimează că dacă biotehnologia va fi adoptată pe deplin, până la sfârșitul anului 2006-2015, profiturile tuturor țărilor în termeni de PIB vor crește cu 210 miliarde dolari pe an.

Observațiile din primele zile ale culturilor tolerante la erbicide în agricultură oferă dovezi convingătoare că fermierii au fost capabili să controleze buruienile mai eficient. În același timp, câmpurile de afânare și arat își pierd din importanță ca mijloc de combatere a buruienilor. Ca urmare, se reduce consumul de combustibil pentru tractor, se îmbunătățește structura solului și se previne erodarea acestuia. Programele insecticide vizate pentru cultivarea bumbacului Bt includ mai puține pulverizări ale culturilor și, prin urmare, mai puține vizite pe teren, ceea ce duce la mai puțină eroziune a solului. Toate acestea contribuie fără să vrea la introducerea tehnologiei de conservare a solului care vizează reducerea eroziunii solului, nivelul de dioxid de carbon și reducerea pierderilor de apă.

Starea actuală a științei se caracterizează printr-o abordare integrată, crearea de platforme tehnologice unificate pentru realizarea unei game largi de cercetări. Ele combină nu numai biotehnologia, biologia moleculară și ingineria genetică, ci și chimia, fizica, bioinformatica, transcriptomica, proteomica, metabolomica.

Lectură recomandată
1. J. Watson. Biologia moleculară a genei. M.: Mir. 1978.
2. Stent G., Kalindar R. Genetica moleculară. M.: Mir. 1981
3. S.N. Shchelkunov „Inginerie genetică”. Novosibirsk, Siberian University Press, 2008
4. Glik B. Biotehnologie moleculară. Principii și aplicare / B. Glick, J. Pasternak. M .: Mir, 2002
5. Ingineria genetică a plantelor. Manual de laborator. Editat de J. Draper, R. Scott, F. Armitage, R. Walden. M .: „Mir”. 1991.
6. Agrobiotehnologia în lume. Ed. Scriabin K.G. M .: Centrul „Bioinginerie” RAS, 2008. - 135 p.
7. Clark. D., Russell L. Biologia moleculară este o abordare simplă și distractivă. M .: CJSC „Compania KOND”. 2004

Legături
1. „Cu privire la reglementarea de stat a activităților de inginerie genetică”. FZ-86 astfel cum a fost modificat. 2000, articolul 1
2. Protocolul de la Köln, Lucrarea de la Köln, adoptată la conferința „Towards a Knowledge-Based Bioeconomy” (Köln, 30 mai 2007), organizată de Uniunea Europeană în timpul Președinției germane a UE.

.(Sursa: „Biologie. Enciclopedie ilustrată modernă.” Ed. A. P. Gorkin; Moscova: Rosmen, 2006.)


Vedeți ce este „ingineria genetică” în alte dicționare:

    Inginerie genetică- o secțiune de genetică moleculară asociată cu crearea intenționată in vitro de noi combinații de material genetic (ADN recombinant) capabil să se reproducă și să funcționeze în celula gazdă. O sursă … Dicționar-carte de referință de termeni ai documentației normative și tehnice

    La fel ca ingineria genetică... Dicţionar enciclopedic mare

    Conform definiției Legii federale privind reglementarea statului în domeniul activității de inginerie genetică din 5 iunie 1996, un set de tehnici, metode și tehnologii, incl. tehnologii de producere a acizilor ribonucleici și dezoxiribonucleici recombinanți, conform... Dicţionar juridic

    GENE ENGINEERING, tehnică de creare a unei molecule de ADN (acid dezoxiribonucleic) cu gena dorită, care este apoi introdusă în celula unei bacterii, ciuperci (drojdii), plante sau mamifer astfel încât să producă proteina necesară. Metodologie ...... Dicționar enciclopedic științific și tehnic

    O ramură a geneticii care dezvoltă tehnici de manipulare a NK și utilizează aceste metode pentru cercetarea genetică și producerea de organisme cu genomi mixți, inclusiv cele utile pentru medicină și economia națională. (Sursa: Glosar de termeni ... ... Dicţionar de microbiologie

    Inginerie genetică- un set de metode și tehnologii, inclusiv tehnologii pentru producerea acizilor ribonucleici și dezoxiribonucleici recombinanți, pentru izolarea genelor din organism, manipularea genelor și introducerea lor în alte organisme; ... Sursa... Terminologie oficială

    Inginerie genetică- - Subiecte de biotehnologie EN inginerie biomoleculară ... Ghidul tehnic al traducătorului

    INGINERIE GENETICĂ- un set de tehnici, metode și tehnologii, incl. tehnologii de producere a acizilor ribonucleici (ARN) și dezoxiribonucleici (ADN) recombinanți, pentru izolarea genelor din organism, manipularea genelor și introducerea lor în altele ... ... Enciclopedie juridică

    Termen de inginerie genetică Termen englezesc inginerie genetică Sinonime inginerie genetică Abrevieri Termeni înrudiți livrarea genelor, bioinginerie, motoare biologice, genom, ADN, ARN, oligonucleotidă, plasmidă, enzimă, terapie genică... Dicţionar enciclopedic de nanotehnologie

    La fel ca ingineria genetică. * * * INGINERIA GENETICĂ INGINERIA GENETICĂ, la fel ca ingineria genetică (vezi INGINERIA GENETICĂ) ... Dicţionar enciclopedic

    Inginerie genetică- Inginerie genetică Inginerie genetică Tehnologia ADN recombinant. Schimbarea cu ajutorul metodelor biochimice și genetice a materialului cromozomial - principala substanță ereditară a celulelor. Materialul cromozomal constă din ...... Explicativ Dicționar englez-rus pe nanotehnologie. - M.

Cărți

  • Inginerie genetică în biotehnologie. Manual, Zhuravleva Galina Anatolyevna. Manualul „Inginerie genetică în biotehnologie” a fost întocmit în conformitate cu standardul educațional de stat federal pentru învățământul profesional superior la specialitatea 020400 „Biologie” și se bazează pe prelegeri susținute de mai bine de 10 ani la Facultatea de Biologie ...