Основы морфологии микроорганизмов. Морфологическая характеристика основных групп микроорганизмов. Химические компоненты бактериальной клетки

Принято считать одноклеточных организмов, размер которых не превышает 0,1 мм. Представители этой многочисленной группы могут иметь различную клеточную организацию, морфологические признаки и возможности метаболизма, то есть главным признаком, объединяющим их, является размер. Сам термин «микроорганизм» не наделен таксономическим смыслом. Микробы принадлежат к самым разным таксономическим единицам, причем другие представители этих единиц могут быть многоклеточными и достигать больших размеров.

Общие подходы к классификации микроорганизмов

В результате постепенного накопления фактического материала о микробах возникла необходимость введения правил для их описания и систематизации.

Для классификации микроорганизмов характерно наличие следующих таксонов: домен, филум, класс, порядок, семейство, род, вид. В микробиологии ученые используют биномиальную систему характеристики объекта, то есть номенклатура включает названия рода и вида.

Для большинства микроорганизмов характерно крайне примитивное и универсальное строение, следовательно, их разбиение на таксоны невозможно осуществить только по морфологическим признакам. В качестве критериев привлекаются и функциональные особенности, и молекулярно-биологические данные, и схемы протекания биохимических процессов и т. д.

Особенности идентификации

Чтобы идентифицировать неизвестный микроорганизм проводят исследования по изучению следующих свойств:

1. Цитология клеток (прежде всего принадлежность к про- или эукариотическим организмам).
2. Морфология клеток и колоний (в конкретных условиях).
3. Культуральные характеристики (особенности роста на разных средах).
4. Комплекс физиологических свойств, на котором основана классификация микроорганизмов по типу дыхания (аэробные, анаэробные)
5. Биохимические признаки (наличие или отсутствие определенных метаболических путей).
6. Набор молекулярно-биологических свойств, включающий учет последовательности нуклеотидов, возможности гибридизации нуклеиновых кислот с материалом типовых штаммов.
7. Хемотаксономические показатели, подразумевающие учет химического состава различных соединений и структур.
8. Серологические характеристики (реакции «антиген - антитело»; особенно для патогенных микроорганизмов).
9. Наличие и характер чувствительности к специфическим фагам.

Систематика и классификация микроорганизмов, относящихся к прокариотам, осуществляется с помощью «Руководства Берджи по систематике бактерий». А идентификация осуществляется с использованием определителя Берджи.

Различные способы классификации микробов

Чтобы определить таксономическую принадлежность того или иного организма, применяют несколько методов классификации микроорганизмов.

При формальной нумерической классификации все признаки считаются одинаково значимыми. То есть учитывается наличие или отсутствие того или иного признака.

Морфофизиологическая классификация подразумевает изучение совокупности морфологических свойств и особенностей протекания метаболических процессов. В данном случае наделяется смыслом и значимость того или иного свойства у объекта. Помещение микроорганизма в ту или иную и присвоение имени зависят прежде всего от типа клеточной организации, морфологии клеток и колоний, а также характера роста.

Учет функциональных характеристик предусматривает возможность использования микроорганизмами различных питательных веществ. Также важна зависимость от определенных физико-химических факторов среды, а в частности пути получения энергии. Есть такие микробы, для идентификации которых необходимо проведение хемотаксономических исследований. Патогенные микроорганизмы нуждаются в серодиагностике. Для интерпретации результатов вышеуказанных тестов применяется определитель.

При молекулярно-генетической классификации анализируют строение молекул важнейших биополимеров.

Порядок идентификации микрорганизмов

В наше время идентификация конкретного микроскопического организма начинается с выделения его чистой культуры и проведения анализа нуклеотидной последовательности 16S рРНК. Таким образом, осуществляется определение места микроба на филогенетическом древе, а последующая конкретизация по роду и виду проводится с помощью традиционных микробиологических методов. Значение совпадений, равное 90 % позволяет определить родовую принадлежность, а 97 % - видовую.

Еще более четкая дифференцировка микроорганизмов по роду и виду возможна при использовании полифилетической (полифазной) таксономии, когда определение последовательностей нуклеотидов сочетается с использованием информации различных уровней, вплоть до экологического. То есть предварительно осуществляется поиск групп схожих штаммов с последующим определением филогенетических позиций этих групп, фиксацией различий между группами и их ближайшими соседями, сбором данных, позволяющих дифференцировать группы.

Основные группы эукариотических микроорганизмов: водоросли

Этот домен включает в себя три группы, где есть микроскопические организмы. Речь идет о водорослях, простейших и грибах.

Водоросли являются одноклеточными, колониальными или многоклеточными фототрофами, осуществляющими оксигенный фотосинтез. Разработка молекулярно-генетической классификации микроорганизмов, относящихся к этой группе, еще не закончена. Поэтому на данный момент на практике применяется классификация водорослей на основе учета состава пигментов и запасных веществ, строения клеточной стенки, наличия подвижности и способа размножения.

Типичными представителями этой группы являются одноклеточные организмы, принадлежащие к динофлагеллятным, диатомовым, эвгленовым и зеленым водорослям. Для всех водорослей характерно образование хлорофилла и различных форм каротиноидов, а вот способность к синтезу других форм хлорофиллов и фикобилинов у представителей группы проявляется по-разному.

Сочетание тех или иных пигментов обусловливает окрашивание клеток в различные цвета. Они могут быть зелеными, бурыми, красными, золотистыми. Пигментация клеток является видовой характеристикой.

Диатомовые водоросли являются одноклеточными планктонными формами, у которых имеет вид кремниевого двустворчатого панциря. Часть представителей способна к передвижению по типу скольжения. Размножение как бесполое, так и половое.

Местами обитания одноклеточных являются пресноводные водоемы. Передвигаются при помощи жгутиков. Клеточной стенки нет. Способны к росту в условиях темноты за счет процесса окисления органических веществ.

У динофлагеллят особое строение клеточной стенки, она состоит из целлюлозы. У этих планктонных одноклеточных водорослей имеются два боковых жгутика.

Для микроскопических представителей местами обитания являются пресные и морские водоемы, почва и поверхность разных наземных объектов. Есть неподвижные виды, а некоторые способны к передвижению с использованием жгутиков. Так же как у динофлагеллят, у зеленых микроводорослей есть целлюлозная клеточная стенка. Характерно запасание крахмала в клетках. Размножение осуществляется как бесполым, так и половым способом.

Эукариотические организмы: простейшие

Основные принципы классификации микроорганизмов, принадлежащих к простейшим, основаны на морфологических характеристиках, которые сильно различаются у представителей данной группы.

Они могут вести неподвижный образ жизни или передвигаться с помощью различных приспособлений: жгутиков, ресничек и ложноножек. Внутри таксономической группы простейших есть еще несколько групп.

Представители простейших

Амебы осуществляют питание путем эндоцитоза, передвигаются при помощи ложноножек, суть размножения заключается в примитивном надвое. Большая часть амеб - свободноживущие водные формы, однако есть и такие, которые вызывают болезни человека и животных.

В клетках инфузорий имеются два разных ядра, бесполое размножение заключается в поперечном делении. Есть представители, для которых характерно половое размножение. В движении принимает участие скоординированная система ресничек. Эндоцитоз осуществляется путем захвата пищи специальной ротовой полостью, а остатки выводятся через отверстие на заднем конце. В природе инфузории обитают в загрязненных органическими веществами водоемах, а также рубце жвачных животных.

Для жгутиконосцев характерно наличие жгутиков. Поглощение растворенных питательных веществ осуществляется всей поверхностью ЦПМ. Деление происходит только в продольном направлении. Среди жгутиконосцев есть как свободноживущие, так и симбиотические виды. Основные симбионты человека и животных - трипаносомы (вызывают сонную болезнь), лейшмании (вызывают труднозаживающие язвы), лямблии (приводят к кишечным расстройствам).

У споровиков из всех простейших самый сложный жизненный цикл. Самый известный представитель споровиков - малярийный плазмодий.

Эукариотические микроорганизмы: грибы

Классификация микроорганизмов по относит представителей этой группы к гетеротрофам. Для большинства характерно образование мицелия. Дыхание, как правило, аэробное. Но встречаются и факультативные анаэробы, которые могут переключиться на спиртовое брожение. Способы размножения - вегетативное, бесполое и половое. Именно этот признак служит критерием для дальнейшей

Если говорить о значении представителей этой группы, то наибольший интерес здесь представляет сборная нетаксономическая группа дрожжей. Туда входят грибы, у которых отсутствует мицелиальная стадия роста. Среди дрожжей много факультативных анаэробов. Однако встречаются и патогенные виды.

Основные группы микроорганизмов-прокариотов: археи

Морфология и классификация микроорганизмов-прокариотов объединяет их в два домена: бактерии и археи, представители которых имеют много существенных отличий. У архей нет типичных для бактерий пептидогликановых (муреиновых) клеточных стенок. Для них характерно наличие другого гетерополисахарида - псевдомуреина, в котором нет N-ацетилмурамовой кислоты.

Археи делятся на три филума.

Особенности строения бактерий

Принципы классификации микроорганизмов, объединяющие микробов в данный домен, основаны на особенностях строения клеточной оболочки, а в частности содержании в ней пептидогликана. На данный момент в домене насчитывается 23 филума.

Бактерии - это важное звено круговорота веществ в природе. Суть их значения в этом глобальном процессе состоит в разложении растительных и животных остатков, очищении загрязненных органикой водоемов, модифицировании неорганических соединений. Без них существование жизни на Земле стало бы невозможным. Эти микроорганизмы живут везде, их метом обитания могут быть почва, вода, воздух, организм человека, животных и растений.

По форме клеток, наличию приспособлений для движения, сочленению клеток между собой этого домена осуществляется внутри последующая классификация микроорганизмов. Микробиология рассматривает следующие типы бактерий исходя из формы клеток: округлые, палочковидные, нитчатые, извитые, спиралевидные. По типу движения бактерии могут быть неподвижными, жгутиковыми или передвигаться за счет выделения слизи. Исходя из способа сочленения клеток друг с другом, бактерии могут быть изолированными, сцепленными в виде пар, гранул, также встречаются ветвящиеся формы.

Патогенные микроорганизмы: классификация

Патогенных микроорганизмов много среди палочковидных бактерий (возбудители дифтерии, туберкулеза, брюшного тифа, сибирской язвы); простейших (малярийный плазмодий, токсоплазма, лейшмания, лямблия, трихомонада, некоторые патогенные амебы), актиномицетов, микобактерий (возбудители туберкулеза, проказы), плесневых и дрожжеподобных грибов (возбудители микозов, кандидоза). Грибы способны вызвать всевозможные поражения кожи, например разные виды лишая (за исключением опоясывающего, в появлении которого участвует вирус). Некоторые дрожжи являясь постоянными обитателями кожи, в условиях нормальной работы иммунной системы не оказывают пагубного влияния. Однако если активность иммунитета снижается, то они вызывают появление себорейного дерматита.

Группы патогенности

Эпидемиологическая опасность микроорганизмов является критерием для объединения всех болезнетворных микробов в четыре группы, соответствующие четырем категориям риска. Таким образом, группы патогенности микроорганизмов, классификация которых приведена ниже, представляют наибольший интерес для микробиологов, так как напрямую влияют на жизнь и здоровье населения.

Наиболее безопасная, 4-я группа патогенности, включает микробов, не представляющих угрозы здоровью отдельного человека (или риск этой угрозы ничтожно мал). То есть опасность заражения очень мала.

3-я группа характеризуются умеренным риском заражения для отдельного индивида, низким риском для общества в целом. Такие патогены теоретически могут вызвать заболевание, и даже если это произойдет, то имеются проверенные эффективные методы лечения, а также комплекс профилактических мер, способных предотвратить распространение инфекции.

Во 2-ю группу патогенности входят микроорганизмы, представляющие высокие показатели риска для индивидуума, но низкие для общества в целом. В этом случае патоген может вызывать тяжелое заболевание у человека, однако распространения его от одного инфицированного к другому не происходит. Эффективные методы лечения и профилактики имеются.

1-я группа патогенности характеризуется высоким риском как для индивидуума, так и для общества в целом. Патоген, вызывающий тяжелое заболевание у человека или животного, может легко передаваться различными способами. Эффективные методы лечения и профилактические меры обычно отсутствуют.

Патогенные микроорганизмы, классификация которых определяет их принадлежность к той или иной группе патогенности, приносят большой урон здоровью общества, только если относятся к 1-й или 2-й группе.

ЗАНЯТИЕ № 1

ТЕМА: ОСНОВНЫЕ МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ГРУППЫ МИКРООРГАНИЗМОВ. МОРФОЛОГИЯ И УЛЬТРАСТРУКТУРА БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТКИ.

ПЕРЕЧЕНЬ КОНТРОЛЬНЫХ ВОПРОСОВ

Формы и размеры истинных бактерий. Характеристика шарообразных, палочковидных и извитых форм истинных бактерий.

Структура бактерий. Основные отличия прокариотной клетки от эукариотной.

Клеточная стенка грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Типы микроскопических препаратов. Техника приготовления фиксированных препаратов.

Техника микроскопии в световом микроскопе. Изучение морфологии микроорганизмов в электронном микроскопе.

Тинкториальные свойства микробов. Красители. Простые способы окраски фиксированных препаратов.

Принципы классификации патогенных прокариот (Берджи, 2001).

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

1 Ознакомиться с организацией работы кафедры, оснащением и режимом работы бактериологической лаборатории.

2 Приготовить препараты-мазки стафилококка со скошенного агара, зафиксировать, окрасить водно-спиртовым раствором метиленового синего.

3 Изучить правила и технику иммерсионной микроскопии.

4 Приготовить мазки из смеси бульонных культур кишечной палочки, антракоида, сарцин, зафиксировать, окрасить водным раствором фуксина.

5 В демонстрационных препаратах изучить морфологию микроорганизмов :

Стрептококки в чистой культуре	Пневмококки в органах белых мышей	Гонококки в гное уретры	Вибрионы в чистой культуре	Боррелии в мазке крови
Окраска по Граму х1000	Окраска по Граму х1000	Окраска по Граму х1000	Окраска по Граму х1000	х1000 Окраска по Романовскому -Гимзе
Грам+кокки расположены цепочкой	Грам+кокки расположены парами (диплококки) окружены слизистой капсулой,	Грам- кокки бобовидной формы расположены парами (диплококки)	Грам- подвижные палочки слегка изогнутой формы формы расположены беспорядочно	Подвижные изогнутые (3-8 завитков), сине-фиолетового цвета располагаются беспорядочно

(указать методы окраски микроскопических препаратов и особенности морфологии микроорганизмов – форму и расположение в препарате)

Формы и размеры истинных бактерий. Характеристика шарообразных, палочковидных и извитых форм истинных бактерий.

Микробиология – (от греч. micros-малый, bios-жизнь, logos-учение) – наука, изучающая строение, жизнедеятельность и экологию микроорганизмов – мельчайших форм живых организмов, которые невозможно увидеть невооруженным глазом. Микробиология изучает всех представителей микромира (бактерии, грибы, простейшие, вирусы). Микроорганизмы в зависимости от молекулярно-биологической организации подразделяют на прокариотов и эукариотов. Прокариоты (от греч. karion-ядро) – доядерные простейшие одноклеточные формы жизни, не имеющие ядерной мембраны и высокоорганизованных органелл. К ним относятся бактерии, актиномицеты и сине-зеленные водоросли. К эукариотам, имеющим оформленное ядро и высокоорганизованные органеллы относятся одноклеточные и многоклеточные организмы – простейшие, грибы, водоросли (кроме сине-зеленных).

Структура бактерий. Основные отличия прокариотной клетки от эукариотной.

По форме клеток собственно бактерии подразделяются на шаровидные, палочковидные и извитые. Шаровидные бактерии-кокки, имеют сферическую форму. Одни располагаются беспорядочно (микрококки), другие парами (диплококки), третьи – цепочками (стрептококки), четвертые в виде пакетов, состоящих из четырех (тетракокки) или восьми (сарцины) кокков. Кокки располагающиеся скоплениями напоминающими виноградную гроздь называют стафилококками. Палочковидные бактерии, имеющие цилиндрическую форму, различаются по форме клеток, размером. Извитые формы бактерии представлены изогнутыми палочками изгибы, которых имеют один или несколько оборотов спирали.

Клетка – универсальная структурная единица живой материи . Организация бактериальной клетки такова, что она позволяет ей координировать все процессы жизнедеятельности, за определенный срок удваивать свою биомассу и размножаться путем бинарного деления. В составе бактериальной (прокариотической) клетки можно выделить различные структуры:клеточная стенка (по химической структуре которых, различают грамположительные и грамотрицательные бактерии), периплазматическое пространство, цитоплазматическая мембрана, цитоплазма, нуклеоид (генетический материал), мезосома (у эукариотов митохондрии), включения, рибосомы, у некоторых бактерии – капсула, микрокапсула, жгутик, плазмида, донорная ворсинка, фимбрии (реснички), спора.

Клеточная стенка – прочная, упругая, структура, придающая бактерии определенную форму и вместе с подлежащей цитоплазматической мембраной, сдерживающая высокое осмотическое давление в клетке. Они участвуют в процессе деления и транспорте метаболитов. Клеточная стенка грамположительных бактерии имеет однородную структуру, пластичный слой, слой тонкий и ковалентно связан с ригидным слоем. Она значительно толще, чем у грамотрицательных – ее толщина 20-60 нм. Основную массу стенки составляет пептидогликан. Он представлен не 1-2 слоями, как у грамотрицательных бактерий, а 5-6. С пептидогликаном ковалентно связаны тейхоевые кислоты (от греч. teichos-стенка). Особенностью пептидогликанов грамположительных бактерии является то, что в них часто нет диаминопимелиновой кислоты. В клеточной стенке грамположительных бактерии содержится небольшое количество липидов, полисахаридов и белков. Клеточная стенка грамотрицательных бактерий значительно тоньше, толщина составляет 14-18 нм. Основная особенность в том, что ригидный слой тонкий, представлен 1-2 слоями пептидогликана, в котором почти всегда имеется диаминопимелиновая кислота. В составе клеточной стенки содержится много липопротеинов, фосфолипидов, липополисахарид, больше белка, и, как правило, отсутствует тейхоевые кислоты. Пластичный слой клеточной стенки представляет сложную мозаику, образованную из липопротеинов, липополисахаридов и наружной мембраны. Нарушение синтеза, клеточной стенки лежит в основе L-трансформации бактерий. Она может быть обратимой и необратимой. Факторами, индуцирующими ее, являются различные антибиотики, угнетающие биосинтез клеточной стенки (пенициллин, циклосерин), ферменты (лизоцим, амидаза), антимикробные антитела, высокие концентрации некоторых аминокислот, особенно глицина и фенилаланина. L-трансформация является частной причиной перехода острых форм заболеваний в хронические и их обострений, и является одной из форм приспособления к неблагоприятным условиям существования. Протопласты – полное лишение клеточной, а частичное лишение – сферопласты.

Характеристика структурных элементов бактериальной клетки: цитоплазматической мембраны, капсулы, жгутиков, донорных ворсинок, фимбрий, или ресничек, спор – их химическая структура, биологическое значение для бактериальной клетки.

Цитоплазматическая мембрана (ЦМ) является исключительно полифункциональной структурой: воспринимает всю химическую информацию, поступающую в клетку из внешней среды, является основным осмотическим барьером: участвует в регуляции роста и клеточного деления бактерии, в процессах транспорта питательных веществ в клетку, участвует в синтезе компонентов клеточной стенки и др. На долю ЦМ приходится 10% сухого веса бактерий. Она содержит 25-40% фосфолипидов, образующих два слоя, 20-75% белков и до 6% углеводов. Цитоплазма бактерий представляет собой сложную коллоидную систему в ней нет эндоплазматического ретикулума и других цитоплазматических органелл, свойственных эукариотам, она не подвижна. В ней находятся нуклеоид, плазмиды, рибосомы, мезосомы, включения, гранулы гликогена, волютина. У разных биологических групп бактерий могут быть и другие внутрицитоплазматические включения метаболического происхождения. Между ЦМ и внутренним слоем пептидогликана находятся периплазматическое пространство, которое играет существенную роль во взаимодействии ЦМ и клеточной стенки, в нем содержится различные ферменты: по преимуществу фосфатазы, связывающие белки, олигосахариды и др. вещества.

У бактерий различают микрокапсулу, капсулу и слизистый слой. Они относятся к факторам патогенности (болезнетворности) бактериальной клетки, так как они сохраняют (защищают) его от защитных факторов организма человека и животных. Микрокапсула выявляется при электронной микроскопии в виде коротких мукополисахаридных фибрилл. Капсула представляет собой слизистый слой и служит внешним покровом бактерий, толщина ее более 0,2 мкм, она четко обнаруживается под микроскопом после окрашивания по способу Бурри-Гинса. В образовании капсулы принимает участие ЦМ.

Совместно с клеточной стенкой и ЦМ они образуют мощную оболочку бактерии, предохраняют от высыхания, несут для них запасные питательные вещества.

У бактерии органом движения являются жгутики, которые представляют собой тонкие длинные нитевидные белковые образования диаметром 12-30 нм и длиной от 6-9 до 80 мкм. Белок, из которого построены жгутики, получили название флагеллина.

По характеру расположение жгутиков и их количеству подвижные бактерии делят на 4 группы:

Монотрихи – один полярно расположенный жгутик.

Лофотрихи – пучок жгутиков на одном конце

Амфитрихи – пучки жгутиков на обоих концах клетки

Перитрихи – множество жгутиков, расположенных вокруг клетки.

Жгутик состоит из трех компонентов – спиральной жгутиковой нити, крючка и базального тельца. У бактерий, являющихся носителями конъюгативных плазмид, имеются длинные нитевидные структуры белковой природы, получившие название донорных ворсинок, или донорных пилей.

Фимбрии – короткие нити, в большом количестве окружающие бактериальную клетку, они прикреплены к клеточной стенке, но значительно короче и тоньше. С их помощью бактерии прикрепляются к чувствительным клеткам.

Некоторые роды бактерий при неблагоприятных для их существования условиях образуют защитные формы – споры. Споры представляют собой своеобразные покоящиеся клетки: у них низкая метаболическая активность, но они обладают высокой устойчивостью к высушиванию, действию повышенной температуры и различных химических веществ. Диаметр споры может не превышать диаметра вегетативной клетки или превышает его. Споры в клетке могут располагаться центрально, 7

субтерминально, терминально. В процессе спорообразования бактериальная клетка подвергается сложной перестройке. Сформировавшаяся эндоспора состоит из протопласта с нуклеоидом, стенки споры, кортекса, оболочки и экзоспория. У многих видов грамотрицательных бактерий, не образующих спор, существует особое приспособительное состояние, физиологически эквивалентное цистам, при котором такие бактерии не размножаются и сохраняют жизнеспособность и получили название некультивируемых форм бактерий (НФБ). НФБ обладают высокой устойчивостью во внешней среде.

Клеточная стенка грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Окраска по методу Грама (модификация Синева). При окраске по Граму в клетках на уровне клеточной стенки идет образование комплекса генцианового фиолетового + йод. Этот комплекс не растворим в воде и слабо растворим в спирте. При обработке этанолом он проходит через клеточную оболочку грамотрицательных микроорганизмов и выводится, клетки становятся бесцветными, при докрашивании фуксином они приобретают красный цвет. Клеточная стенка грамположительных бактерий, благодаря присутствию большого количества пептидогликана и меньшему диаметру спор, способствует удержанию образовавшегося комплекса, и клетки сохраняют сине-фиолетовый цвет. Способность окрашиваться по Граму – достаточно видовой признак, иногда может зависеть от возраста клеток.

Типы микроскопических препаратов. Техника приготовления фиксированных препаратов.

Техника микроскопии в световом микроскопе. Изучение морфологии микроорганизмов в электронном микроскопе.

Микроскоп состоит из двух частей – оптической и механической. К оптической части относятся объективы, которые состоят из фронтальной и коррекционных линз, с их помощью достигается увеличение объекта и коррекция его оптического изображения. Объективы подразделяются на сухие и иммерсионные. Предельная разрешающая способность иммерсионного микроскопа 0,2 мкм. Общее увеличение микроскопа определяется произведением увеличения объектива на увеличение окуляра.

Порядок микроскопии препаратов с иммерсионным объективом:

На приготовленный и окрашенный мазок нанести небольшую каплю иммерсионного масла, поместить препарат на предметный столик.

Установить иммерсионный объектив 90.

Осторожно опустить тубус микроскопа до погружения объектива в каплю масла.

Установить ориентировочный фокус при помощи макрометрического винта.

Провести окончательную фокусировку препарата микрометрическим винтом. Нельзя допускать соприкосновение объектива с препаратом, возможна поломка препарата или фронтальной линзы. По окончании работы необходимо тряпочкой тщательно вытереть масло с иммерсионного объектива .

Темнопольная микроскопия основана на использовании эффекта Тиндаля (дифракция света при сильном боковом освещении взвешенных в жидкости мельчайших частиц). Для этого обычный конденсор в микроскопе заменяется на параболоид или кардиоид конденсор. Краевые лучи, выходящие из темнопольного конденсора, проходят в косом направлении, не попадают в объектив, в связи, с чем поле зрения остается темным. В объектив поступают отраженные от объектива лучи, образуя характерное изображение ярко светящихся контуров микробных клеток, находящихся в препарате на темном фоне.

Фазово-контрастная микроскопия основана на превращении изменений по фазе, возникающих при прохождении световой волны через прозрачные (фазовые) объекты, в изменения по амплитуде, в результате чего прозрачные объекты становятся видимыми в микроскоп. При этом достигается высокая контрастность изображения, которая может быть позитивной (темное изображение объекта в светлом поле зрения) или негативной (светлое изображение объекта на темном фоне).

Люминесцентная или флюоресцентная микроскопия основана на явлении фотолюминесценции (свечение объекта под влиянием света). Первичная (собственная) люминесценция наблюдается без предварительного окрашивания объекта, вторичная (наведенная) возникает после окраски препаратов люминесцирующими красителями – флюорохромами. Достоинствами этого метода микроскопии являются возможность исследования живых микроорганизмов и обнаруживания их в исследуемом материале в небольших концентрациях вследствие высокой степени контрастности.

Электронная микроскопия применяется для исследования объектов, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности светового микроскопа (вирусов, макромолекулярных структур и др. субмикроскопических структур), а также для изучения тонкого строения различных микроорганизмов. Основана на использовании вместо световых лучей, потока электронов, имеющего длину около 0,005 нм, т.е. почти в 100 000 раз короче волны видимого света. Высокая разрешающая способность электронного микроскопа (0,1-0,2 нм) позволяет получить полезные увеличения до 1 000 000 раз. Кроме приборов "просвечивающего" типа используют сканирующие электронные микроскопы, дающие рельефное изображение поверхности объекта.

Тинкториальные свойства микробов. Красители. Простые способы окраски фиксированных препаратов.

Для количественного учета, изучения морфологии, выявления спор, капсул, органоидов, включений мазок необходимо зафиксировать и окрасить. Мазок готовят на обезжиренном стекле, на который наносят небольшое количество воды. В этой капле эмульгируют исследуемый материал, который распределяют тонким слоем на поверхности около 2 см.. Если культура в жидкой среде, то его берут петлей или стерильной пипеткой и каплю наносят непосредственно на стекло (без воды). После этого мазок высушивают на воздухе и фиксируют. В процессе фиксации микробные клетки погибают, этим достигается безопасность работы с ними, что особенно важно для работы с патогенными микроорганизмами. Убитые микроорганизмы лучше воспринимают красители, чем живые. Кроме того, в фиксированном мазке клетки прикрепляются к стеклу и не смываются при последующей обработке.

Методы фиксации. Физический метод – фиксация мазка над пламене горелки или спиртовки в течение нескольких секунд мазком вверх. Химический метод – более мягкий. При этом мазок погружают в фиксатор на определенное время или жидкость наливают на мазок. В качестве фиксаторов используют: 1) этанол – 10-15 мин; 2) ацетон – 5 мин; 3) смесь Никифорова (этанол+эфир – 1:1) – 1015 мин; 4) метанол – 3 мин; 5) формалин (несколько секунд). После фиксации мазок можно окрашивать.

Окраску мазков производят простым или сложными методами . При простых методах мазок окрашивают каким либо одним красителем, используя красители анилинового ряда (кислые). Наливают краситель на фиксированный мазок на определенное время и смывают водой, высушивают и микроскопируют в иммерсионной системе. Сложные методы окраски применяют для изучения структуры клетки и дифференсации микроорганизмов при этом используют несколько красителей, в некоторых случаях спирты, кислоты.

Принципы классификации патогенных прокариот (Берджи, 2001).

Все микроорганизмы различаются друг от друга по многим признакам, и прежде всего по уровню организации геномов, наличию и составу белоксинтезирующих систем и клеточной стенки. В соответствии с этими признаками все известные живые существа делят на 4 царства: Эукариоты, эубактерии, архебактерии, вирусы и плазмиды. К прокариотам, объединяющим эубактерии и архебактерии, относятся бактерии, низкие водоросли, спирохеты, актиномицеты, риккетсии, микоплазмы. Простейшие, дрожжи и нитчатые грибы – эукариоты. Систематика занимается описанием видов организмов, выяснением степени родственных отношений между ними и объединением их в различные классификационные единицы (таксоны). Основной таксономической единицей в биологии является вид. Последующие таксономические единицы: род, семейство, порядок и класс. Это обязательные категории. Подрод, подриба, триба, подсемейство подпорядок, подкласс – дополнительные категории. Согласно определителю Берги, царство прокариот в зависимости от характера их клеточных стенок разделено на 4 большие группы, или отдела.

1) Грациликуты или тонкокожие – к нему относятся грамположительные бактерии.

2) Фирмикуты или толстокожие – к нему относятся грамположительные бактерии.

3) Тенерикуты или нежнокожие – организмы, не имеющие клеточной стенки – микоплазмы.

4) Мендосикуты – бактерии, большинство из которых хотя и имеют клеточную стенку, но она не содержит пептидогликана – сюда относятся архебактерии.

По классификации Берги все прокариоты делятся на 17 частей. Для обозначения видов бактерий используют бинарную номенклатуру, состоящую из названия рода (пишется с заглавной буквы) и вида (пишется всегда со строчной буквы и состоит из одного слова).

Бактериологические, вирусологические лаборатории входят в состав санитарно-эпидемиологических станций (СЭС) и крупных больниц. В лабораториях СЭС выполняются бактериологические, вирусологические, серологические анализы материалов полученных от больных и контактирующих с ними лиц, обследуются бактерионосители и проводятся санитарно-микробиологические исследования воды, воздуха, почвы, пищевых продуктов и пр. В бактериологических и серологических лабораториях больниц проводятся диагностические исследования при кишечных и гнойных инфекциях (дифтерии, туберкулеза и др.), а также исследования по контролю за качеством дезинфекции и стерилизации. Диагностика особо опасных инфекций (чумы, холера, туляремия, бруцеллез, сибирская язва и др.) проводятся в специальных лабораториях. В вирусологических лабораториях проводятся диагностика заболеваний вызванных вирусами (грипп, корь, краснуха, клещевой энцефалит, полиомиелит и др.) хламидиями (орнитоз и др.) и риккетсиями (сыпной тиф, Ку-лихорадка и др.)

В каждой лаборатории предусмотрены следующие помещения:

1) бокс для работы с отдельными группами бактерий или вирусами в асептических условиях;

2) специально оборудованное помещение для стерилизации (автоклавная), для стерилизации питательных сред, посуды, обеззараживания отработанного инфицированного материала;

3) моечная, оборудованная для мытья посуды;

4) оборудованная комната для иммунологических (серологических) исследований;

5) помещение для приготовления питательных сред;

6) помещение для приготовления препаратов и посевов;

7) виварий с боксами для содержания лабораторных животных;

8) регистратура для приема, выдачи анализов.

Лаборатории оснащены следующими оборудованием: биологическими иммерсионными микроскопами, с дополнительными приспособлениями (осветитель, фазово-контрастное устройство, темнопольный конденсор и др.), люминесцентным микроскопом, термостатами, анаэростатами, приборами для стерилизации (автоклав, сушильный шкаф), рН-метрами, дистиллятором, центрифугами, весами аппаратурой для фильтрования, водяными банями, холодильниками, аппаратом для изготовления ватно-марлевых пробок, набором инструментов (бактериологические петли, шпатели, иглы, пинцеты и др.), лабораторной посудой (пробирки, колбы, чашки Петри, флаконы, ампулы, пипетки и др.). Все помещения лаборатории должны быть обеспечены вентиляцией, водопроводом, канализацией, электроэнергией. Стены должны быть окрашены масляной краской или покрыты кафельной плиткой, пол линолеум. В крупных лабораториях имеются термостатные комнаты для массового выращивания микроорганизмов. Каждое рабочее место лаборатории должно быть снабжено газовой горелкой или спиртовкой, банкой с дезинфицирующим раствором. Лабораторные столы оборудуются микроскопом с осветителем, набором красителей и реактивов для окраски препаратов, бактериальными петлями, крючком, иглой, шпателем, Пастеровскими и градуированными пипетками, предметными и покровными стеклами, пинцетами, ванночкой для приготовления и окраски мазков, ватой в стеклянном сосуде, карандашом по стеклу, фильтровальной бумагой.

Учитывая, что работа в микробиологической лаборатории медицинского учреждения проводится с возбудителями инфекционных заболеваний, персонал для предохранения от заражения, должен строго соблюдать правила внутреннего порядка:

1) Входить в лабораторию и работать в ней только в медицинских халатах, шапочках и в сменной обуви. В необходимых случаях персонал надевает на лицо маску из марли. Работа с особо опасными микроорганизмами регламентируется спец. инструкцией и проводится в режимных лабораториях.

2) В лабораториях запрещается принимать пищу, курить.

3) Рабочее место должно содержаться в образцовом порядке, личные вещи сотрудников следует хранить в специально отведенном месте.

4) При случайном попадании инфекционного материала на стол, пол, одежду, обувь это место необходимо обработать дезинфицирующим раствором.

5) Использованные пипетки, предметные стекла, шпатели, ватные тампоны необходимо помещать в сосуд с дезинфицирующим раствором. Пинцеты, бактериальные петли, иглы следует прожигать в пламени горелки.

6) Обработанные культуры, использованный микробный материал, трупы зараженных животных необходимо сдавать для обеззараживания.

7) Хранение, наблюдение за культурами микроорганизмов и их уничтожение должны проводится согласно специальной инструкции. Все культуры патогенных микроорганизмов регистрируются в специальном журнале.

Подавляющее большинство бактерий одноклеточны. По форме клеток они могут быть округлыми (кокки), палочковидными (бациллы, клостридии, псевдомонады), извитыми (вибрионы, спириллы, спирохеты), реже - звёздчатыми, тетраэдрическими, кубическими, C- или O-образными. Формой определяются такие способности бактерий, как прикрепление к поверхности, подвижность, поглощение питательных веществ. Отмечено, например, что олиготрофы, то есть бактерии, живущие при низком содержании питательных веществ в среде, стремятся увеличить отношение поверхности к объёму, например, с помощью образования выростов (т. н. простек).

Из обязательных клеточных структур выделяют три:*нуклеоид *рибосомы *цитоплазматическая мембрана (ЦПМ)

С внешней стороны от ЦПМ находятся несколько слоёв (клеточная стенка, капсула, слизистый чехол), называемых клеточной оболочкой, а также поверхностные структуры (жгутики, ворсинки). ЦПМ и цитоплазму объединяют вместе в понятие протопласт.

2.Генетика вирусов. Патогенные для человека вирусы обладают двумя основными свойствами - наследственностью и изменчивостью , изучение которых составляет предмет особой научной дисциплины - генетики вирусов.Популяционную структуру вирусов и характер протекающих в них процессов определяют следующие факторы. Высокая численность популяции , что увеличивает вероятность мутаций, которые могут быть подхвачены естественным отбором при изменении условий существования вирусов. Быстрая смена поколений позволяет изучать изменчивость вирусов не только в эксперименте, по и наблюдать их естественную эволюцию в природе. Гаплоидностъ и бесполый способ размножения определяют: генетическую чистоту популяции (отсутствие гибридов); невозможность сохранения запасов изменчивости за счёт диплоидности; немедленное попадание мутантов под контроль отбора.

Малая ёмкость генома и отсутствие повторяющихся генов . Для реализации инфекционного цикла необходима функциональная целостность всех генов.

Незначительное изменение одного из них может вызвать летальный или условно-летальный эффект для вируса.

Непрерывность в динамике эпидемического процесса , так как обязательное условие сохранения в природе - передача новым чувствительным хозяевам. Вирусные популяции хорошо адаптированы к внешним условиям и не претерпевают существенных изменений в течение продолжительного времени. При изменении условий для выживания популяции становится необходимой перестройка наследственной структуры , обеспечивающая адаптацию к новой среде. Подобная перестройка возможна лишь при наличии в общем генофонде популяции изменённых генов. Генофонд вирусных популяций создаётся и пополняется из четырёх основных источников: внутренние факторы: мутации, рекомбинации. Внешние: включение в геном генетического материала клетки-хозяина (появление геномов, содержащих новый материал), Фенотипическая смешивание(обогащение генофонда за счёт поступления генов из других вирусных популяций).

3.Возбудители холеры. Таксономия. Характеристика. Микробиологическая диагностика. Специфическая профилактика и лечение. Семейство Vibrionaceae, род Vibrio, вид V. cholerae.Холера - древний антропоноз; со времен Гиппократа известна как "magi mara" - "великий мор". Уносила миллионы жизней. Карантинная инфекция.

Морфология. Грам(-), слегка изогнутые палочки (вид запятой. спор и капсул (кроме штамма Бенгал) не образуют; штамм Бенгал образует капсулу в организме. Облигатные аэробы. Монотрихи, длина жгутика может в 2-3 раза превышать длину сомы, что обуславливает высокую подвижность. Культуральныесвойства. Хорошо растут на простых питательных средах с щелочной реакцией (pH 8,5 - 9,5). На 1% пептонной воде образует нежную пленку (аэроб). На щелочном агаре - чаще гладкие прозрачные колонии с голубоватым оттенком, реже (в процессе диссоциации) - шероховатые и складчатые колонии. Биохимические свойства. В лабораторной практике используется биохимическая классификация по Хейбергу (для всего рода Vibrio). Выделяют 8 групп, возбудители холеры относятся к 1й группе (манноза к, сахароза к, арабиноза -). Образуют индол. Антигенная структура: (1) общий видо специфический H-АГ - жгутиковый (2) типо специфический О-АГ - соматический По О-АГ выделяют 80 серогрупп; V. cholerae, el-tor - серогруппа 01 (02 вызывает энтериты, гастроэнтериты). О1-АГ состоит из фракций А, В и С, их сочетания образуют серовары. 3 серовара : Инаба (АС), Огава (АВ) (основные возбудители), Гикошима (АВС) (промежуточный вариант). Штамм bengal - серовар 0-139. Факторы патогенности: (1) жгутики - активное продвижение бактерий к энтероцитам в слое слизи; (2) адгезивность - пили; (3) капсула у штамма Бенгал; (4) токсины : 1 типа - эндотоксин (О-АГ), 2 типа – экзоэнтеротоксин - холероген, основной признак; идентичен у всех трех возбудителей. 2 субъединицы: В - нетоксична, способствует адгезии токсина к энтероцитам; А - собственно токсин, проникает в энтероциты, где активирует АЦ, что приводит к накоплению цАМФ, который усиливает секрецию воды, натрия и хлора из клеток и нарушает всасывание калия; 3 типа - термостабильный токсин , поражает натрий-калиевую АТФазу; в результате - диарея, резкое обезвоживание организма; (5) нейраминидаза - способствует адгезии вибрионов на энтероцитах и проникновению в клетку; Заболевание. Источник - больной, вибрионоситель. Резервуар - гидробионты. Путь заражения - алиментарный, при употреблении инфицированной воды (овощи, гидробионты etc.). Основные клинические формы - холерный энтерит, гастроэнтерит. Инкубационный период - несколько часов - 6 дней. Первый симптом - диарея, Второй симптом - обильная многократная рвота фонтаном, обезвоживания, обессоливания организма, мышечной слабости, головокружению, осиплости голоса, резкой потере тургора кожи. Микробиологическая диагностика : (1) экспресс-методы : для определения АГ возбудителей: РИФ, РНГА по Рыцаю, метод иммобилизации вибрионов с помощью О-холерной сыворотки; учет в темнополевом и фазово-контрастном микроскопе. (2) основной метод - бактериологический .(3) дополнительный - серологический: определение вибриоцидных АТ в сыворотке пациента с помощью реакции бактериолиза (для реконвалесцентов). (4) генетический - использование молекулярно-генетических зондов к генам tox+ возбудителей токсина. Лечение . В первую очередь - восстановление водно-солевого обмена, а затем - использование антибиотиков, химиотерапии. Восстановление водно-солевого обмена должно производиться путем введения солевых растворов per os или в/в: KCl, NaCl, NaHCO3, глюкоза etc. Объем вводимой и выводимой жидкости должен строго контролироваться.Профилактика. 6-месячный иммунитет, не профилактируют штамм Бенгал. 1) вакцина холерная корпускулярная инактивированная из V. cholerae, V. el-tor; 2) химическая холерная вакцина - моно (содержит холероген-анатоксин и О-АГ серовара Инаба); 3)химическая холерная вакцина - би (серовары Огава, Инаба).

1.Принципы классификации бактерий. Для бактерий ре­комендованы следующие таксономические категории: класс, отдел, порядок, семейство, род, вид. Название вида соответствует бинар­ной номенклатуре, т. е. состоит из двух слов. Например, возбудитель сифилиса пишется как Treponema pallidum . Первое слово - название рода и пишется с прописной буквы, второе слово обозначает вид и пишется со строчной буквы. При повторном упоминании вида родовое название сокращается до на­чальной буквы, например: Т. pallidum . Бактерии относятся к прокариотам, т. е. доядерным организмам, поскольку у них имеется примитивное ядро без оболочки, ядрышка, гистонов, а в цитоплазме отсутс­твуют высокоорганизованные органеллы Бактерии делят на 2 домена: « Bacteria » и « Archaea ». В домене « Bacteria » можно выделить следующие бактерии:

1) бактерии с тонкой клеточной стенкой, грамм(-);

2) бактерии с толстой клеточной стенкой, грамм(+);

3) бакт. без КС (класс Mollicutes - микоплазмы)

Архебактерии не содержат пептидогликан в клеточной стенке. Они имеют особые рибосомы и рибосомные РНК (рРНК). Среди тонкостенных грамм(-) эубактерий различают:

Сферические формы, или кокки (гонококки, менингококки, вейлонеллы);

Извитые формы - спирохеты и спириллы;

Палочковидные формы, включая риккетсии.

К толстостенным грамм(+) эубактериям относят:

Сферические формы, или кокки (стафилококки, стрептококки, пневмококки);

Палочковидные формы, а также актиномицеты (ветвящиеся, нитевидные бактерии), коринебактерии (булавовидные бак­терии), микобактерии и бифидобактерии.

Тонкостенные грамм(-) бактерии: Менингококки, гонококки, Вейлонеллы, Палочки, Вибрионы, Кампилобактерии, Хеликобактерии, Спириллы, Спирохеты, Риккетсии, Хламидии.

Толстостенные грамм(+) бактерии: Пневмококки, Стрептококки, Стафилококки, Палочки, Бациллы, Клостридии, Коринебактерии, Микобактерии, Бифидобактерии, Актиномицеты.

2.Механизмы лекарственной устойчивости возбудителей инфекционных болезней. Пути ее преодоления. Антибиотикорезистентность - это устойчивость микробов к антимикробным химиопрепаратам. Бактерии следует считать резистентными, если они не обезвреживаются такими концентрациями препарата, которые реально создаются в макроорганизме. Резистентность может быть природной и приобретенной.

Природная устойчивость . Некоторые виды микробов природно устойчивы к определенным семействам антибиотиков или в результате отсутствия соответствующей мишени (например, микоплазмы не имеют клеточной стенки, поэтому не чувствительны ко всем препаратам, действующим на этом уровне), или в результате бактериальной непроницаемости для данного препарата (например, грамотрицательные микробы менее проницаемы для крупномолекулярных соединений, чем грамположительные бактерии, так как их наружная мембрана имеет «маленькие» поры).

Приобретенная устойчивость. Приобретение резистентности - это биологическая закономерность, связанная с адаптацией микроорганизмов к условиям внешней среды. Она, хотя и в разной степени, справедлива для всех бактерий и всех антибиотиков. К химиопрепаратам адаптируются не только бактерии, но и остальные микробы - от эукариотических форм (простейшие, грибы) до вирусов. Проблема формирования и распространения лекарственной резистентности микробов особенно значима для внутрибольничных инфекций, вызываемых так называемыми «госпитальными штаммами», у которых, как правило, наблюдается множественная устойчивость к антибиотикам (так называемая полирезистентность).

Генетические основы приобретенной резистентности. Устойчивость к антибиотикам определяется и поддерживается генами резистентности (r-генами) и условиями, способствующими их распространению в микробных популяциях. Приобретенная лекарственная устойчивость может возникать и распространяться в популяции бактерий в результате:

Мутаций в хромосоме бактериальной клетки с последующей селекцией (т. е. отбором) мутантов. Особенно легко селекция происходит в присутствии антибиотиков, так как в этих условиях мутанты получают преимущество перед остальными клетками популяции, которые чувствительны к препарату. Мутации возникают независимо от применения антибиотика, т. е. сам препарат не влияет на частоту мутаций и не является их причиной, но служит фактором отбора. Далее резистентные клетки дают потомство и могут передаваться в организм следующего хозяина (человека или животного), формируя и распространяя ре-зистентные штаммы. Мутации могут быть: 1) единичные (если мутация произошла в одной клетке, в результате чего в ней синтезируются измененные белки) и 2) множественные (се¬рия мутаций, в результате чего изменяется не один, а целый набор белков, например пени-циллинсвязывающих белков у пенициллин-резистентного пневмококка);

Переноса трансмиссивных плазмид резистентности (R-плазмид). Плазмиды резистентности (трансмиссивные) обычно кодируют перекрестную устойчивость к нескольким семействам антибиотиков. Впервые такая множественная резистентность была описана японскими исследователями в отношении кишечных бактерий. Сейчас показано, что она встречается и у других групп бактерий. Некоторые плазмиды могут передаваться между бактериями разных видов, поэтому один и тот же ген резистентности можно встретить у бактерий, таксономически далеких друг от друга. Например, бета-лактамаза, кодируемая плазмидой ТЕМ-1, широко распространена у грамотрицательных бактерий и встречается у кишечной палочки и других кишечных бактерий, а также у гонококка, резистентного к пенициллину, и гемофильной палочки, резистентной к ампициллину;

Переноса транспозонов, несущих r-гены (или мигрирующих генетических последовательностей). Транспозоны могут мигрировать с хромосомы на плазмиду и обратно, а также с плазмиды на другую плазмиду. Таким образом гены резистентности могут передаваться далее дочерним клеткам или при рекомбинации другим бактериям-реципиентам.

Реализация приобретенной устойчивости. Изменения в геноме бактерий приводят к тому, что меняются и некоторые свойства бактериальной клетки, в результате чего она становится устойчивой к антибактериальным препаратам. Обычно антимикробный эффект препарата осуществляется таким образом: агент должен связаться с бактерией и пройти сквозь ее оболочку, затем он должен быть доставлен к месту действия, после чего препарат взаимодействует с внутриклеточными мишенями. Реализация приобретенной лекарственной устойчивости возможна на каждом из следующих этапов:

модификация мишени . Фермент-мишень может быть так изменен, что его функции не нарушаются, но способность связываться с химиопрепаратом (аффинность) резко снижается или может быть включен «обходной путь» метаболизма, т. е. в клетке активируется другой фермент, который не подвержен действию данного препарата.

«недоступность» мишени за счет снижения проницаемости клеточной стенки и клеточных мембран или «эффлюко-механизма, когда клетка как бы «выталкивает» из себя антибиотик.

инактивация препарата бактериальными ферментами. Некоторые бактерии способны продуцировать особые ферменты, которые делают препараты неактивными (например, бета-лактамазы, аминогликозид-модифицирующие ферменты, хлорамфениколацетилтрансфераза). Бета-лактамазы - это ферменты, разрушающие бета-лактамное кольцо с образованием неактивных соединений. Гены, кодирующие эти ферменты, широко распространены среди бактерий и могут быть как в составе хромосомы, так и в составе плазмиды.

Для борьбы с инактивирующим действием бета-лактамаз используют вещества - ингибиторы (например, клавулановую кислоту, сульбактам, тазобактам). Эти вещества содержат в своем составе бета-лактамное кольцо и способны связываться с бета-лактамазами, предотвращая их разрушительное действие на бета-лактамы. При этом собственная антибактериальная активность таких ингибиторов низкая. Клавулановая кислота ингибирует большинство известныхбета-лактамаз. Ее комбинируют с пеницил-линами: амоксициллином, тикарциллином, пиперациллином.

Предупредить развитие антибиотикорезистентности у бактерий практически невозможно, но необходимо использовать антимикробные препараты таким образом, чтобы не способствовать развитию и рас-пространению устойчивости (в частности, применять антибиотики строго по показаниям, избегать их использования с профилактической целью, через 10-15 дней ан-тибиотикотерапии менять препарат, по воз-можности использовать препараты узкого спектра действия, ограниченно применять антибиотики в ветеринарии и не использвать их как фактор роста).

Микроорганизмы (от лат. micros - малый) - организмы, невидимые невооруженным глазом. К ним относятся простейшие, спирохеты, грибы, бактерии, вирусы, изучением которых занимается микробиология. Величина микроорганизмов измеряется в микрометрах (мкм). В микромире существует большое разнообразие форм, которые делятся на группы с учетом общих принципов биологической классификации.

Первой общей биологической классификацией была созданная в XVIII веке система шведского ученого К. Линнея, основанная на морфологических признаках и включавшая животный и растительный мир. С развитием науки в классификации стали учитывать не только морфологические, но и физиологические, биохимические и генетические особенности микроорганизмов. В настоящее время невозможно говорить об единой классификации всех живых организмов: сохраняя единые принципы, классификации макро- и микроорганизмов имеют свои особенности.

Основными ступенями всех классификаций являются: царство - отдел - класс (группа) - порядок - семейство - род - вид. Главной классификационной категорией является вид - совокупность организмов, имеющих общее происхождение, сходные морфологические и физиологические признаки и обмен веществ.

Микроорганизмы относятся к царству прокариотов, представители которых, в отличие от эукариотов, не обладают оформленным ядром. Наследственная информация у прокариотов заключена в молекуле ДНК, располагающейся в цитоплазме клетки.

Для микроорганизмов принята в 1980 г. единая международная классификация, в основе которой лежит система, предложенная американским ученым Берги.

Для того чтобы определить, к какому виду относится микроорганизм, необходимо с помощью различных методов изучить его особенности (форму клетки, спорообразование, подвижность, ферментативные свойства) и по определителю найти его систематическое положение - идентифицировать.

Внутри вида существуют варианты: морфоварианты отличаются по морфологии, биоварианты - по биологическим свойствам, хемоварианты - по ферментативной активности, сероварианты - по антигенной структуре, фаговарианты - по чувствительности к фагам.

Для обозначения микроорганизмов принята общебиологическая бинарная или биноминальная (двойная) номенклатура, введенная К.Линнеем. Первое название обозначает род и пишется с прописной буквы. Второе название обозначает вид и пишется со строчной буквы. Например, Staphylococcus aureus - стафилококк золотистый. В названиях могут быть отражены имена исследователей, открывших микроорганизмы: бруцеллы - в честь Брюса, эшерихии - в честь Эшериха и т. д. В ряд наименований включены органы, которые поражает данный микроорганизм: пневмококки - легкие, менингококки - мозговую оболочку и т. д.

Бактерии

Бактерии - это одноклеточные организмы, лишенные хлорофилла. Средние размеры бактериальной клетки - 2-6 мкм. Размеры и форма клеток бактерий, присущие микроорганизмам определенного вида, могут изменяться под влиянием различных факторов (в зависимости от возраста бактериальной культуры, среды обитания и пр). Это явление называется полиморфизмом.

По форме клетки бактерии делятся на три группы: шаровидные, палочковидные и извитые (рис. 4).

Шаровидные бактерии называются кокки (от лат. coccus - ягода) и имеют диаметр клетки от 0,5 до 1 мкм. Форма кокков разнообразна: сферическая, ланцетовидная, бобовидная. По взаимному расположению клеток после деления среди кокков выделяют: микрококки (от лат. micros - малый) - клетки делятся в разных плоскостях и располагаются поодиночке; диплококки (от лат. diploos - двойной) - клетки делятся в одной плоскости и затем располагаются попарно; к ним относятся ланцетовидные пневмококки и бобовидные гонококки и менингококки; стрептококки (от лат. streptos - цепочка) - клетки делятся в одной плоскости и не расходятся, образуя цепочку; стафилококки (от лат. staphyle - гроздь) - клетки делятся в различных плоскостях, образуя скопления в виде грозди винограда; тетракокки (от лат. tetra - четыре) - клетки делятся в двух взаимно перпендикулярных плоскостях и располагаются по четыре; сарцины (от лат. sarcio - соединяю) - клетки делятся в трех взаимно перпендикулярных плоскостях и располагаются в виде тюков или пакетов по 8 или 16 клеток в каждом.

Кокки широко распространены во внешней среде, а также в организме человека и животных. Почти все группы кокков, исключая микрококки, тетракокки и сарцины, включают возбудителей инфекционных заболеваний.

Палочковидные формы называются бактериями. Средние размеры их от 1 до 6 мкм в длину и от 0,5 до 2 мкм в толщину.

Бактерии различаются по внешнему виду: концы их могут быть закругленными (кишечная палочка), обрубленными (возбудитель сибирской язвы), заостренными (возбудитель чумы) или утолщенными (возбудитель дифтерии). После деления бактерии могут располагаться попарно - диплобактерии (клебсиеллы), цепочкой (возбудитель сибирской язвы), иногда под углом друг к другу или крест-накрест (возбудитель дифтерии). Большинство бактерий располагается беспорядочно.

Среди бактерий встречаются изогнутые формы - вибрионы (возбудитель холеры).

К извитым формам относятся спириллы и спирохеты. Форма их клетки напоминает спираль. Большинство спирилл неболезнетворны.

Строение бактериальной клетки

Для изучения строения бактериальной клетки наряду со световым микроскопом применяют электронно-микроскопические и микрохимические исследования, позволяющие определить ультраструктуру бактериальной клетки.

Бактериальная клетка (рис. 5) состоит из следующих частей: трехслойной оболочки, цитоплазмы с различными включениями и ядерного вещества (нуклеоида). Дополнительными структурными образованиями являются капсулы, споры, жгутики, пили.

Оболочка клетки состоит из наружного слизистого слоя, клеточной стенки и цитоплазматической мембраны.

Слизистый капсульный слой находится снаружи клетки и выполняет защитную функцию.

Клеточная стенка - один из основных структурных элементов клетки, сохраняющий ее форму и отделяющий клетку от окружающей среды. Важным свойством клеточной стенки является избирательная проницаемость, которая обеспечивает проникновение в клетку необходимых питательных веществ (аминокислот, углеводов и др.) и выведение из клетки продуктов обмена. Клеточная стенка сохраняет внутри клетки постоянное осмотическое давление. Прочность стенки обеспечивает муреин, вещество полисахаридной природы. Некоторые вещества разрушают клеточную стенку, например лизоцим.

Бактерии, полностью лишенные клеточной стенки, называются протопластами. Они сохраняют способность к дыханию, делению, синтезу ферментов; к воздействию внешних факторов: механическому повреждению, осмотическому давлению, аэрации и др. Сохранить протопласты можно только в гипертонических растворах.

Бактерии с частично разрушенной клеточной стенкой называются сферопластами. Если подавить процесс синтеза клеточной стенки с помощью пенициллина, то образуются L-формы, которые у всех видов бактерий представляют шаровидные крупные и мелкие клетки с вакуолями.

Цитоплазматическая мембрана плотно прилегает к клеточной стенке с внутренней стороны. Она очень тонкая (8-10 нм) и состоит из белков и фосфолипидов. Это пограничный полупроницаемый слой, через который осуществляется питание клетки. В мембране находятся ферменты пермеазы, осуществляющие активный перенос веществ, и ферменты дыхания. Цитоплазматическая мембрана образует мезосомы, принимающие участие в делении клетки. При помещении клетки в гипертонический раствор мембрана может отделиться от клеточной стенки.

Цитоплазма - внутреннее содержимое бактериальной клетки. Она представляет собой коллоидную систему, состоящую из воды, белков, углеводов, липидов, различных минеральных солей. Химический состав и консистенция цитоплазмы изменяются в зависимости от возраста клетки и условий окружающей среды. В цитоплазме находятся ядерное вещество, рибосомы и различные включения.

Нуклеоид, ядерное вещество клетки, ее наследственный аппарат. Ядерное вещество прокариотов в отличие от эукариотов не имеет собственной мембраны. Нуклеоид зрелой клетки представляет собой двойную нить ДНК, свернутую в кольцо. В молекуле ДНК закодирована генетическая информация клетки. По генетической терминологии ядерное вещество получило название генофор или геном.

Рибосомы находятся в цитоплазме клетки и выполняют функцию синтеза белка. В состав рибосомы входит 60% РНК и 40% белка. Количество рибосом в клетке достигает 10000. Соединяясь вместе, рибосомы образуют полисомы.

Включения - гранулы, содержащие различные запасные питательные вещества: крахмал, гликоген, жир, волютин. Они расположены в цитоплазме.

Клетки бактерий в процессе жизнедеятельности образуют защитные органеллы - капсулы и споры.

Капсула - внешний уплотненный слизистый слой, примыкающий к клеточной стенке. Это защитный орган, который появляется у некоторых бактерий при попадании их в организм человека и животных. Капсула предохраняет микроорганизм от защитных факторов организма (возбудители пневмонии и сибирской язвы). Некоторые микроорганизмы имеют постоянную капсулу (клебсиеллы).

Споры встречаются только у палочковидных бактерий. Они образуются при попадании микроорганизма в неблагоприятные условия внешней среды (действие высоких температур, высыхание, изменение рН, уменьшение количества питательных веществ в среде и т. д.). Споры находятся внутри бактериальной клетки и представляют уплотненный участок цитоплазмы с нуклеоидом, одетый собственной плотной оболочкой. По химическому составу они отличаются от вегетативных клеток малым количеством воды, увеличенным содержанием липидов и солей кальция, что способствует высокой устойчивости спор. Спорообразование происходит в течение 18-20 ч; при попадании микроорганизма в благоприятные условия спора в течение 4-5 ч прорастает в вегетативную форму. В бактериальной клетке образуется только одна спора, следовательно, споры не являются органами размножения, а служат для переживания неблагоприятных условий.

Спорообразующие аэробные бактерии называются бациллами, а анаэробные - клостридиями.

Споры отличаются по форме, размерам и расположению в клетке. Они могут располагаться центрально, субтерминально и терминально (рис. 6). У возбудителя сибирской язвы спора располагается центрально, ее размер не превышает поперечника клетки. Спора возбудителя ботулизма расположена ближе к концу клетки - субтерминально и превышает ширину клетки. У возбудителя столбняка округлая спора располагается на конце клетки - терминально и значительно превышает ширину клетки.

Жгутики - органы движения, характерны для палочковидных бактерий. Это тонкие нитевидные фибриллы, состоящие из белка - флагеллина. Длина их значительно превышает длину бактериальной клетки. Жгутики отходят от базального тельца, расположенного в цитоплазме, и выходят на поверхность клетки. Наличие их можно обнаружить по определению подвижности клеток под микроскопом, в полужидкой питательной среде или при окраске специальными методами. Ультраструктура жгутиков изучена в электронном микроскопе. По расположению жгутиков бактерии делят на группы (см. рис. 6): монотрихи - с одним жгутиком (возбудитель холеры); амфитрихи - с пучками или единичными жгутиками на обоих концах клетки (спириллы); лофотрихи - с пучком жгутиков на одном конце клетки (фекальный щелочеобразователь); перитрихи - жгутики расположены по всей поверхности клетки (кишечные бактерии). Скорость движения бактерий зависит от количества и расположения жгутиков (наиболее активны монотрихи), от возраста бактерий и влияния окружающих факторов.

Пили или фимбрии - ворсинки, расположенные на поверхности бактериальных клеток. Они короче и тоньше жгутиков и также имеют спиральную структуру. Состоят пили из белка - пилина. Одни пили (их несколько сотен) служат для прикрепления бактерий к клеткам животных и человека, с другими (единичными) связана передача генетического материала из клетки в клетку.

Микоплазмы

Микоплазмы - клетки, не имеющие клеточной стенки, но окруженные трехслойной липопротеидной цитоплазматической мембраной. Микоплазмы могут быть сферической, овальной формы, в виде нитей и звезд. Микоплазмы по классификации Берги выделены в отдельную группу. В настоящее время этим микроорганизмам уделяется все большее внимание как возбудителям заболеваний воспалительного характера. Размеры их различны: от нескольких микрометров до 125-150 нм. Мелкие микоплазмы проходят через бактериальные фильтры и называются фильтрующимися формами.

Спирохеты

Спирохеты (см. рис. 52) (от лат. speira - изгиб, chaite - волосы) - тонкие, извитые, подвижные одноклеточные организмы, имеющие размеры от 5 до 500 мкм в длину и 0,3-0,75 мкм в ширину. С простейшими их роднит способ движения путем сокращения внутренней осевой нити, состоящей из пучка фибрилл. Характер движения спирохет различен: поступательное, вращательное, сгибательное, волнообразное. В остальном строение клетки типичное для бактерий. Некоторые спирохеты слабо окрашиваются анилиновыми красителями. Спирохеты разделяют на роды по количеству и форме завитков нити и ее окончанию. Кроме сапрофитных форм, распространенных в природе и организме человека, среди спирохет имеются болезнетворные - возбудители сифилиса и других заболеваний.

Риккетсии

Вирусы

Среди вирусов выделяют группу фагов (от лат. phagos - пожирающий), вызывающих лизис (разрушение) клеток микроорганизмов. Сохраняя присущие вирусам свойства и состав, фаги отличаются структурой вириона (см. главу 8). Они не вызывают заболеваний человека и животных.

Контрольные вопросы

1. Расскажите о классификации микроорганизмов.

2. Назовите основные свойства представителей царства прокариотов.

3. Перечислите и охарактеризуйте основные формы бактерий.

4. Назовите основные органеллы клетки и их назначение.

5. Дайте краткую характеристику основных групп бактерий и вирусов.

Изучение морфологии микроорганизмов

Для изучения морфологии микроорганизмов применяют микроскопический метод исследования. Важным условием успешного использования этого метода является правильное приготовление мазка из исследуемого материала или бактериальной культуры. Культурой называются микроорганизмы, выращенные на питательных средах в лабораторных условиях.

Техника приготовления мазка

Для работы необходимо иметь чистые и обезжиренные предметные и покровные стекла. Новые стекла кипятят 15-20 мин в 2-5% растворе соды или мыльной воде, споласкивают водой и помещают в слабую хлороводородную кислоту, затем тщательно промывают водой.

Стекла, бывшие в употреблении и загрязненные красителями или иммерсионным маслом, можно обработать двумя способами: 1) погрузить на 2 ч в концентрированную серную кислоту или хромовую смесь, а затем тщательно промыть; 2) кипятить 30-40 мин в 5% растворе соды или щелочи. Необработанные стекла можно обезжирить, натерев их мылом, а затем очистить от него сухой тканью.

Внимание! Если стекло хорошо обезжирено, то капля воды растекается на нем равномерно, не распадаясь на мелкие капли.

Хранят стекла в сосудах с притертыми пробками в смеси Никифорова (равные объемы спирта и эфира) или в 96% спирте. Из растворов стекла извлекают пинцетом.

Внимание! При работе стекла держат пальцами за грани.

Материал для исследования наносят на предметное стекло бактериальной петлей, иглой или пастеровской пипеткой. Чаще всего применяют бактериальную петлю (рис. 7), сделанную из платиновой или нихромовой нити длиной 5-6 см. Петлю закрепляют в петледержателе или впаивают в стеклянную палочку. Конец проволоки сгибают в виде кольца размером 1×1,5 или 2×3 мкм.

Внимание! Правильно приготовленная петля при погружении в воду и извлечении оттуда сохраняет водную пленку.

Перед приготовлением мазка рабочую часть петли прожигают в пламени горелки в вертикальном положении: сначала саму петлю, а затем металлический стержень. Эту манипуляцию проводят и после окончания посева.

Приготовление мазка из культуры, выращенной на жидкой питательной среде . Обезжиренное предметное стекло прожигают в пламени горелки и охлаждают. На предметное стекло, помещенное на подставку (чашку Петри, штатив), наносят культуру. Пробирку с культурой держат большим и указательным пальцами левой руки. Петлю держат в правой руке. Не выпуская петли, мизинцем правой руки прижимают пробку к ладони и осторожно вынимают ее из пробирки. Движения должны быть плавными и спокойными. Горло пробирки обжигают в пламени горелки. Вводят петлю в пробирку. Охлаждают петлю о стенку пробирки и затем погружают ее в культуру. Вынимают петлю, не касаясь ею стенок пробирки. Закрывают пробку, предварительно проведя ее через пламя горелки. Ставят пробирку в штатив. Петлей наносят культуру на предметное стекло, круговыми движениями равномерно распределяя ее. Затем петлю прожигают в пламени горелки. Мазок оставляют для высыхания.

Внимание! Мазок должен быть равномерно растертым, тонким и небольшим (с двухкопеечную монету).

Приготовление мазка из культуры, выращенной на плотной питательной среде . На подготовленное предметное стекло наносят пастеровской пипеткой или петлей каплю изотонического раствора натрия хлорида (0,9%). Культуру осторожно снимают петлей с агара в пробирке или чашке Петри и эмульгируют в капле на стекле. Приготовленный мазок должен быть равномерным и не густым. При его высыхании на предметном стекле остается слабый налет.

Приготовление мазка из гноя или мокроты . Материал забирают стерильной пипеткой или петлей и наносят на середину предметного стекла. Вторым предметным стеклом покрывают первое так, чтобы свободными остались треть первого и второго стекол. Стекла с усилием раздвигают в стороны. Получают два больших мазка.

Приготовление мазка из крови . Каплю крови наносят на предметное стекло на расстоянии одной трети от левого края. Затем краем специально отшлифованного стекла, наклонив его под углом 45°, прикасаются к капле крови. Прижимая отшлифованное стекло к предметному продвигают его вперед. Правильно приготовленный мазок имеет желтоватый цвет и просвечивает.

Приготовление мазков-отпечатков из внутренних органов трупов и пищевых продуктов твердой консистенции . Поверхность органа или пищевого продукта прижигают раскаленным скальпелем и из этого участка вырезают кусочек материала. Пинцетом осторожно захватывают этот кусочек и поверхностью среза прикасаются к предметному стеклу в двух - трех местах, делая ряд мазков-отпечатков.

Высушивание мазка

Мазок высушивают на воздухе при комнатной температуре. В случае необходимости его можно высушить около пламени горелки, держа стекло в горизонтальном положении за края большим и указательным пальцами мазком вверх.

Внимание! При высокой температуре может произойти нарушение структуры клеток.

Фиксация мазка

Мазки фиксируют после полного высыхания с целью: 1) закрепить микроорганизмы на стекле; 2) обезвредить материал; 3) убитые микроорганизмы лучше воспринимают окраску. Фиксированный мазок называется препаратом.

Способы фиксации. 1. Физический - в пламени горелки: стекло берут пинцетом или большим и указательным пальцами и троекратно проводят через верхнюю часть пламени горелки в течение 6 с.

2. Химический - в жидкости: клеточные элементы в мазках из крови и мазках-отпечатках при действии высоких температур разрушаются, поэтому их обрабатывают одной из фиксирующих жидкостей: а) метиловым спиртом- 5 мин; б) этиловым спиртом - 10 мин; в) смесью Никифорова - 10-15 мин; г) ацетоном - 5 мин; д) парами кислоты и формалина - несколько секунд.

Окраска препаратов

После фиксации приступают к окраске препарата.

Окраску препаратов производят на специально оборудованном столе, покрытом линолеумом, пластиком, стеклом и т. д. На столе необходимы сосуд с дистиллированной водой; подставка из двух трубочек или палочек, соединенных резиновыми трубками с обеих сторон (для размещения препаратов); пинцеты, цилиндры, пипетки, фильтровальная бумага, набор красителей, емкость для их слива. Стол для окраски должен находиться рядом с водопроводным краном.

Отношение микроорганизмов к красителям называется их тинкториальными свойствами. В микробиологии широко используют анилиновые красители. Большинство микроорганизмов лучше воспринимает основные красители.

Наиболее употребительны следующие красители: красные (фуксин основной, фуксин кислый, конго красный, нейтральный красный); синие (метиленовый и толуидиновый); фиолетовые (генциановый, метиловый, кристаллический); коричнево-желтые (везувин, хризоидин); зеленые (бриллиантовый, малахитовый).

Все красители выпускают в виде аморфных или кристаллических порошков. Из них готовят насыщенные спиртовые и феноловые растворы, а затем для работы используют водно-спиртовые или водно-феноловые растворы красителей. Если при окраске используют концентрированные растворы красителей, то препарат предварительно накрывают фильтровальной бумагой, на которую наносят краситель. При этом кусочки красителя остаются на бумаге.

Внимание! Каплю красителя наносят пипеткой так, чтобы он покрыл весь препарат.

Рецепты красителей

1. Насыщенные спиртовые растворы (исходные):

Красителя - 1 г спирта 96% - 10 мл

Смесь помещают в термостат до полного растворения на несколько дней. Взбалтывают ежедневно. Хранят в склянках с притертыми пробками.

2. Карболовый фуксин Циля (для окраски кислотоустойчивых микроорганизмов, спор и капсул):

Насыщенного спиртового раствора основного фуксина - 10 мл раствора карболовой кислоты 5% - 90 мл

Внимание! Карболовую кислоту вливают в краситель, а не наоборот.

Смесь в течение нескольких минут энергично встряхивают, фильтруют и сливают во флакон для хранения.

3. Фуксин Пфейффера (для окраски по Граму и для простого метода окраски):

Фуксина Циля - 1 мл воды дистиллированной - 9 мл

Краситель готовят непосредственно перед применением.

4. Карболовый генциановый фиолетовый (для окраски по Граму):

насыщенного спиртового раствора

генцианового фиолетового - 10 мл

карболовой кислоты 5% - 100 мл

Растворы смешивают и фильтруют через бумажный фильтр.

5. Раствор Люголя (для окраски по Граму и реактив на крахмал):

Йодида калия - 2 г кристаллического йода - 1 г дистиллированной воды - 10 мл

Смесь помещают в бутыль матового стекла, хорошо закупоривают и ставят на сутки в термостат, затем добавляют 300 мл дистиллированной воды.

6. Щелочной раствор метиленового синего Леффлера:

Насыщенного спиртового раствора метиленового синего - 30 мл раствора гидроксида калия 1% - 1 мл дистиллированной воды - 100 мл

7. Бумажки по Синеву (для окраски по Граму):

1% спиртовой раствор кристаллического фиолетового

Полоски фильтровальной бумаги пропитывают раствором и высушивают.

Методы окраски делят на ориентировочные (простые) и дифференциальные (сложные), выявляющие химические и структурные особенности бактериальной клетки.

Простой метод окраски

Препарат помещают на подставку для окраски, исследуемым материалом вверх. Пипеткой наносят на него раствор красителя. По истечении указанного времени краситель осторожно сливают, препарат промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой. При простом методе используют один краситель. Метиленовым синим и щелочным синим Леффлера окрашивают препарат в течение 3-5 мин, фуксином Пфейффера - 1-2 мин (см. рис. 4).

На окрашенный и высушенный препарат наносят каплю иммерсионного масла и

Сложные методы окраски

Окраска по Граму (универсальный метод) . Наиболее распространенным методом дифференциальной окраски является окраска по Граму.

В зависимости от результатов окраски все микроорганизмы делят на две группы - грамположительные и грамотрицательные.

Грамположительные бактерии содержат в клеточной стенке магниевую соль РНК, которая образует комплексное соединение с йодом и основным красителем (генциановым, метиловым или кристаллическим фиолетовым). Этот комплекс не разрушается при действии спирта, и бактерии сохраняют фиолетовый цвет.

Грамотрицательные бактерии не способны удержать основной краситель, так как не содержат магниевой соли РНК. Под действием спирта краситель вымывается, клетки обесцвечиваются и окрашиваются дополнительным красителем (фуксином) в красный цвет.

1. На препарат накладывают бумажку по Синеву и наносят несколько капель воды или раствор генцианового фиолетового. Окрашивают 1-2 мин. Снимают бумагу или сливают краситель.

2. Не промывая водой, наносят раствор Люголя до почернения (1 мин), затем краситель сливают.

3. Не промывая водой, наносят 96% спирт до отхождения красителя (30-60 с). Можно опустить препарат в стаканчик со спиртом на 1-2 с.

4. Промывают препарат водой.

5. Докрашивают фуксином Пфейффера 3 мин, промывают водой и высушивают.

Микроскопируют с помощью иммерсионной системы.

Окраска по Цилю - Нильсену (для кислотоустойчивых бактерий) . Этот метод применяют для выявления бактерий туберкулеза и проказы, имеющих в оболочке клеток большое количество липидов, воска и оксикислот. Бактерии кислото-, щелоче- и спиртоустойчивы. Для увеличения проницаемости клеточной стенки первый этап окрашивания проводят при подогревании.

1. Фиксированный препарат покрывают фильтровальной бумагой и наносят фуксин Циля. Удерживая стекло пинцетом, препарат подогревают над пламенем горелки до отхождения паров. Добавляют новую порцию красителя и подогревают еще 2 раза. После охлаждения снимают бумагу и промывают препарат водой.

2. Препарат обесцвечивают 5% раствором серной кислоты, погружая 2-3 раза в раствор или наливая кислоту на стекло, затем несколько раз промывают водой.

3. Окрашивают водно-спиртовым раствором метиленового синего в течение 3-5 мин, промывают водой и высушивают.

Микроскопируют с помощью иммерсионной системы.

Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в красный цвет, остальные - в синий (см. рис. 4).

Окраска по Ожешко (выявление спор) . 1. На высушенный на воздухе мазок наливают несколько капель 0,5% раствора хлороводородной кислоты и подогревают до образования паров. Препарат высушивают и фиксируют над пламенем.

2. Окрашивают по способу Циля - Нильсена. Кислотоустойчивые споры окрашиваются в розово-красный, а бактериальная клетка - в голубой цвет (см. рис. 4).

Окраска по Бурри - Гинсу (выявление капсулы) . Этот метод назван негативным, так как окрашивается фон препарата и бактериальная клетка, а капсула остается неокрашенной.

1. На предметное стекло наносят каплю черной туши, разведенной в 10 раз. В нее вносят каплю культуры. Ребром шлифовального стекла делают мазок, так же как мазок крови, и высушивают.

2. Фиксируют химическим способом спиртом или сулемой. Осторожно промывают водой.

3. Окрашивают фуксином Пфейффера 3-5 мин. Осторожно промывают и высушивают на воздухе.

Внимание! Фильтровальной бумагой не пользоваться, чтобы не повредить препарат.

Микроскопируют с помощью иммерсионной системы. Фон препарата черный, клетки - красные, капсулы - неокрашенные (см. рис. 4).

Прижизненная окраска микроорганизмов

Для изучения живой культуры используют чаще всего метиленовый синий и другие красители в больших разведениях (1:10000). Каплю исследуемого материала смешивают на предметном стекле с каплей красителя и накрывают покровным стеклом. Микроскопируют с помощью объектива 40×.

Изучение подвижности микроорганизмов

Для исследования используют культуру бактерий, выращенных в жидкой питательной среде, или взвесь бактерий в изотоническом растворе натрия хлорида.

Метод раздавленной капли . На предметное стекло наносят пипеткой каплю культуры и покрывают ее покровным стеклом. Чтобы не образовывалось пузырьков воздуха, покровное стекло подводят ребром к краю капли и резко опускают его. Для предохранения препарата от высыхания его помещают во влажную камеру.

Влажная камера представляет собой чашку Петри, на дне которой находится влажная фильтровальная бумага. На бумагу кладут две спички и на них помещают препарат. Чашку закрывают крышкой.

Микроскопируют при увеличении объектива 40х в темном поле (см. главу 2).

Метод висячей капли (рис. 8). Для приготовления препарата необходимы стекло с лункой, покровное стекло и вазелин. Края лунки покрывают тонким слоем вазелина.

На покровное стекло наносят каплю культуры. Затем осторожно накрывают покровное стекло стеклом с лункой так, чтобы капля оказалась в центре. Склеившиеся стекла быстро переворачивают покровным стеклом вверх. Капля находится в герметической камере и сохраняется долгое время. При микроскопии сначала при малом увеличении (8×) находят край капли, а затем проводят изучение препарата при большом увеличении.

Контрольные вопросы

1. Как приготовить бактериальную петлю?

2. Назовите цели и способы фиксации мазков.

3. Назовите основные красители.

4. Какими методами изучают подвижность микроорганизмов?

Задание

1. Возьмите готовые препараты, изучите их и зарисуйте основные формы микроорганизмов.

2. Приготовьте мазки из различного материала (культуры, гноя, крови, мазки-отпечатки).

3. Окрасьте препараты сложными методами (по Граму, Цилю - Нильсену, Ожешко, Бурри - Гинсу).

Прокариоты отличаются от эукариот по ряду основных признаков .

1.Отсутствие истинного дифференцированного ядра (ядерной мембраны).

2.Отсутствие развитой эндоплазматической сети, аппарата Гольджи.

3.Отсутствие митохондрий, хлоропластов, лизосом.

4.Неспособность к эндоцитозу (захвату частиц пищи).

5.Клеточное деление не связано с циклическими изменениями строения клетки.

6. Значительно меньшие размеры (как правило). Большая часть бактерий имеет размеры 0,5- 0,8 микрометров (мкм ) х 2- 3 мкм.

По форме выделяют следующие основные группы микроорганизмов.

1.Шаровидные или кокки (с греч.- зерно).

2.Палочковидные.

3.Извитые.

4.Нитевидные.

Кокковидные бактерии (кокки) по характеру взаиморасположения после деления подразделяются на ряд вариантов.

1.Микрококки . Клетки расположены в одиночку. Входят в состав нормальной микрофлоры, находятся во внешней среде. Заболеваний у людей не вызывают.

2.Диплококки. Деление этих микроорганизмов происходит в одной плоскости, образуются пары клеток. Среди диплококков много патогенных микроорганизмов- гонококк, менингококк, пневмококк.

3.Стрептококки. Деление осуществляется в одной плоскости, размножающиеся клетки сохраняют связь (не расходятся), образуя цепочки. Много патогенных микроорганизмов- возбудители ангин, скарлатины, гнойных воспалительных процессов.

4.Тетракокки . Деление в двух взаимоперпендикулярных плоскостях с образованием тетрад (т.е. по четыре клетки). Медицинского значения не имеют.

5.Сарцины . Деление в трех взаимоперпендикулярных плоскостях, образуя тюки (пакеты) из 8, 16 и большего количества клеток. Часто обнаруживают в воздухе.

6.Стафилококки (от лат.- гроздь винограда). Делятся беспорядочно в различных плоскостях, образуя скопления, напоминающие грозди винограда. Вызывают многочисленные болезни, прежде всего гнойно- воспалительные.

Палочковидные формы микроорганизмов.

1.Бактерии- палочки, не образующие спор.

2.Бациллы- аэробные спорообразующие микробы. Диаметр споры обычно не превышает размера (“ширины”) клетки (эндоспоры).

3.Клостридии- анаэробные спорообразующие микробы. Диаметр споры больше поперечника (диаметра) вегетативной клетки, в связи с чем клетка напоминает веретено или теннисную ракетку.

Необходимо иметь в виду, что термин “бактерия” часто используют для обозначения всех микробов- прокариот. В более узком (морфологическом) значении бактерии- палочковидные формы прокариот, не имеющих спор.

Извитые формы микроорганизмов.

1.Вибрионы и кампилобактерии- имеют один изгиб, могут быть в форме запятой, короткого завитка.

2.Спириллы- имеют 2- 3 завитка.

3.Спирохеты- имеют различное число завитков, аксостиль- совокупность фибрилл, специфический для различных представителей характер движения и особенности строения (особенно концевых участков). Из большого числа спирохет наибольшее медицинское значение имеют представители трех родов- Borrelia, Treponema, Leptospira.

Характеристика морфологии риккетсий, хламидий, микоплазм, более подробная характеристика вибрионов и спирохет будет дана в соответствующих разделах частной микробиологии.

Данный раздел завершаем краткой характеристикой (ключем) для характеристики основных родов микроорганизмов, имеющих медицинское значение, на основе критериев, применяемых в определителе бактерий по Берджи (Berge).

Таблица. Ключ к основным группам бактерий

Основные группы бактерий | Роды бактерий

1.Изгибающиеся бактерии с тонкими стенками, подвиж-

ность обеспечивается за счет скольжения- скользя-

щие бактерии

2.Изгибающиеся бактерии с тонкими стенками, подвижные - Treponema

ность связана с наличием осевой нити- спирохеты Borrelia, Leptospira

3.Ригидные бактерии с толстыми стенками, неподвиж-

ные или подвижные благодаря жгутикам- эубактерии

А. Мицелиальные формы Mycobacterium, Actino-

myces, Nocardia, Strep-

Б.Простые одноклеточные

2/свободноживущие

а. грамположительные:

кокки Streptococcus, Staphy-

неспорообразующие палочки Corynebacterium, Lis-

teria, Erysipelothrix

спорообразующие палочки

в т.ч. обязательные аэробы Bacillus

в т.ч. обязательные анаэробы Clostridium

б. грамотрицательные:

кокки Neisseria

некишечные палочки

в т.ч. спиральной формы Spirillum

в т.ч. прямые, очень мелкие палочки Pasteurella, Brucella,

Yersinia, Francisella,

Haemophilus, Borde-

кишечные палочки

в т.ч. факультативные анаэробы Escherichia, Salmone-

lla, Shigella, Klebsiel-

la, Proteus, Vibrio

в т.ч. облигатные аэробы Pseudomonas

в т.ч. облигатные анаэробы Bacteroides, Fuso-

4.Без клеточных стенок Mycoplasma, Urea-